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双酶体系高效制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇被引量：1: 2016年; 人工合成经密码子优化的羰基还原酶基因Sys1,并与葡萄糖脱氢酶基因Sygdh共克隆至双启动子表达质粒p ETDuet-1中,获重组质粒p ETDuet-Sygdh-Sys1。将其转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),构建了共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的重组工程菌E.coli BL21/p ETDuet-Sygdh-Sys1。以经IPTG诱导的重组菌为生物催化剂,不对称还原间-氯苯甲酰甲基氯(m-CPC),制备手性药物中间体(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇((R)-CCE)。在m-CPC 30 mmol/L、重组湿菌体70 mg/m L、葡萄糖40 mmol/L、辅酶NADP+0.2 mmol/L,以及p H 7.0、反应温度40℃和反应时间3 h等条件下,所获手性化合物(R)-CCE的摩尔产率高达99.0%,对映体过量值(e.e.值)为100%。; 朱利娟余涛顾颖杨标邬敏辰; 关键词：羰基还原酶葡萄糖脱氢酶共表达

新型卤代醇脱卤酶基因的克隆、序列分析及表达被引量：1: 2015年; 卤代醇脱卤酶可以催化合成具有光学纯的环氧化物及β-取代醇等高价值手性药物中间体。作者所在实验室利用宏基因组技术从无锡新区工业集中地污染土壤中筛选了一段编码基因Y,经测序知其片段包含有765 bp的核苷酸,编码254个氨基酸。经Blast软件分析,其氨基酸序列与来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的卤代醇脱卤酶Hhe C同源性为81%,且含有卤代醇脱卤酶类的保守催化三联体Ser132-Thr145-Arg149。推测其属于卤代醇脱卤酶Hhe C类,命名为Sy Hhe C。根据大肠杆菌Escherichia coli BL21的密码子偏爱性,对基因Y进行密码子优化和人工合成,命名为Syhhe C,构建重组表达质粒p ET28a-Syhhe C,转化感受态E.coli BL21,表达产物经镍柱亲和层析后获得电泳纯的重组卤代醇脱卤酶re Sy Hhe C。SDS-PAGE分析,re Sy Hhe C的相对分子质量为34 000。以2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇为底物,re Sy Hhe C催化底物产生2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的比活性为5.2 U/mg。; 冯峰胡蝶余涛曾妍邬敏辰; 关键词：宏基因组技术密码子优化

重组葡萄糖脱氢酶的酶学性质及其偶联辅酶再生被引量：7: 2014年; 为解决生物催化氧化还原反应中辅酶循环问题,人工合成密码子优化后的嗜酸热源体Thermoplasma acidophilum葡萄糖脱氢酶基因Sygdh,于E.coli BL21 （DE3）中表达,粗酶液经镍柱亲和层析获得纯化的重组葡萄糖脱氢酶SyGDH.SDS-PAGE显示相对分子质量为41.0 kDa.酶学性质分析表明：该酶的最适pH值为7.5,在pH 6.0～8.0稳定;最适反应温度为40℃,在55℃以下稳定;最适条件下其比活性达4.5 U/mg; Zn2＋对其有明显激活作用;该酶对NADP＋的亲和力大于NAD＋且对大多数有机溶剂有良好的耐受性;对D-葡萄糖的Km和Vmax值分别为28.2 mmol/L和6.5 U/mg.在葡萄糖脱氢酶与羰基还原酶偶联构建的NADPH辅酶循环体系中,以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物,羰基还原酶催化产物4-氯-3-羟基丁酸乙酯的产率为99.0％,是未添加葡萄糖脱氢酶时产物产率的3.11倍,表明重组SyGDH具有为生物催化氧化还原反应提供辅酶NADPH再生的能力.; 余涛胡蝶邬敏辰汪俊卿冯峰顾颖; 关键词：葡萄糖脱氢酶酶学性质羰基还原酶生物催化

宇佐美曲霉环氧化物水解酶基因的克隆与生物信息学分析被引量：1: 2013年; 环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase,EH)是酶法拆分消旋体环氧化物,制备光学活性环氧化物和邻二醇的重要酶之一。通过RT-PCR和新构建的THSO-PCR侧翼未知DNA序列扩增技术,克隆了一种来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的EH基因,命名为Aueh2(GenBank No.KF061095),并对该基因进行了相关生物信息学分析。Aueh2的DNA序列长度为2 481 bp,其中包含了5′端和3′端侧翼调控序列,6个内含子序列和编码cDNA序列。开放阅读框序列长度为1 188 bp,编码395个氨基酸,对应的蛋白质命名为AuEH2;该蛋白质为无信号肽的亲水蛋白质,其理论相对分子质量44.6 kD;其三维结构包含EH典型的"α/β"核心催化结构域和"帽子"结构域,活性中心由催化三联体Asp191、His369和Glu343组成。本课题研究成果为深入研究AuEH2及其应用奠定了基础。; 胡蝶朱利娟邬敏辰汪俊卿唐存多冯峰余涛; 关键词：宇佐美曲霉基因克隆生物信息学分析

多酶偶联催化制备手性化合物(S)-环氧苯乙烷被引量：2: 2017年; 在水/有机两相中将羰基还原酶SyS1、葡萄糖1-脱氢酶SyGDH和卤代醇脱卤酶CSyHheC偶联催化α-溴代苯乙酮以高效制备(S)-环氧苯乙烷(SO)。第1步反应催化α-溴代苯乙酮不对称还原为(S)-2-溴-1-苯基乙醇((S)-BPE)及NADPH的原位再生,其优化的反应条件:100 mmol/L磷酸钾缓冲液(p H 8.0)/正己烷(V∶V=4∶6)、40 mmol/Lα-溴代苯乙酮、80 mmol/LD-葡萄糖、0.2 mmol/L NADP+和70 mg/m L E.coli/Sygdh-Sys1湿菌体(共表达SyGDH和SyS1),终体积1.0 m L,35℃反应8 h。第2步反应催化(S)-BPE脱卤闭环为(S)-SO,其反应条件:在上述反应体系中加入磷酸钾缓冲液(p H 8.0)和0.3 U SyHheC,终体积2.0 m L,35℃反应30 min。通过连续2步酶催化反应,终产物(S)-SO的摩尔产率为99%、对映体过量值>99%。; 朱利娟胡蝶储亚琴臧嘉余涛邬敏辰

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余涛