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壳聚糖固定化S-腺苷甲硫氨酸合成酶被引量：5: 2013年; 在大肠杆菌中重组表达了S-腺苷甲硫氨酸合成酶,然后以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂,对酶进行固定化研究.结果表明,最佳固定化条件为：壳聚糖质量浓度为2.5g/dL、戊二醛体积分数为0.8％、固定化酶量为6 mg/mL、固定化时间为12 h,该条件下所得固定化酶活性回收率为76％,固定化酶热稳定性较好,在55℃下保温5h仍保留53％的活力,而游离酶在50℃下保温5h则完全失活.固定化酶在碱性溶液环境的稳定性较高,在pH 7.5～9.0的缓冲液中4℃保温10 h酶活性仍保留80％以上.将固定化酶用于S-腺苷甲硫氨酸的合成,连续反应5批次后,酶活性仍保留64％.在底物三磷酸腺苷（ATP）浓度为30 mmol/L的条件下,固定化酶催化底物ATP的转化率超过95％.; 尹春丽陶贵荣许乐牛卫宁; 关键词：S-腺苷甲硫氨酸合成酶壳聚糖固定化酶酶学性质

氨基树脂固定化S-腺苷蛋氨酸（SAM）合成酶制备sAM及光亲和标记探针: S-腺苷蛋氨酸（SAM）是生物体内核酸和蛋白质甲基化的甲基供体,被广泛地用于肝炎、抑郁症以及关节炎等疾病的治疗。酵母发酵法是目前工业化生产SAM的主要途径,但存在底物转化率低、生产周期长、纯化工艺复杂等问题;体外酶促转化...; 牛卫宁曹珊珊羊梦林许乐钦传光; 关键词：氨基树脂重组大肠杆菌; 文献传递

人胱硫醚β合酶I278T突变体的表达、纯化及鉴定: 2014年; 目的探讨在大肠埃希菌中重组表达和纯化人胱硫醚β合酶CBS（I278T）突变体。方法采用重叠延伸聚合酶链反应（PCR）定点突变技术构建突变质粒pGEX4T-1-CBS（I278T）,在含有3%乙醇的培养基中诱导表达,亲和层析纯化得到突变CBS（I278T）蛋白,测定纯化蛋白的活性、紫外可见吸收光谱、蛋白粒径及Zeta电位。结果成功构建了质粒pGEX4T-1-CBS（I278T）。CBS（I278T）蛋白产率、比活性及酶活性回收率分别为2.3mg/L、21.4U/mg、22.6%。终浓度为1mmol/L的S-腺苷甲硫氨酸（AdoMet）对突变CBS（I278T）蛋白没有激活作用。紫外可见吸收光谱分析显示纯化的突变CBS（I278T）存在429nm和550nm的血红素结合蛋白特征吸收峰。蛋白平均粒径为7.5～10.1nm,主要以四聚体形式存在,Zeta电位为-16.3mV。结论成功建立了在大肠埃希菌中表达、纯化及鉴定突变CBS（I278T）的方法。; 牛卫宁许乐羊梦林曹珊珊; 关键词：胱硫醚Β合酶突变粒径 ZETA电位

人胱硫醚β-合酶及其截短型片段的表达、纯化和活性测定被引量：2: 2011年; 将人胱硫醚β-合酶(CBS)基因克隆至质粒pGEX-4T-1中,获得的重组质粒pGEX-4T-1-CBS转入大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)菌株,构建了高效表达CBS的重组菌E.coli Rosetta(pGEX4T-1-CBS)。重组菌在0.1mmol/L的IPTG于30℃诱导16h,可溶性CBS表达量达到28mg/L培养基。将重组菌破碎后上清液经GSTrap Fast Flow亲和层析一步纯化得到CBS融合蛋白,在凝血酶柱上切割缓冲液中加入3%甘油和0.1%CHAPS可以有效抑制酶切后CBS聚沉,酶活性回收率为54.8%,蛋白质产率为15.2mg/L培养基,纯度达到95%,单位酶活为143U/mg,终浓度为1mmol/L的S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)可使CBS单位酶活提高5.1倍,达到735U/mg。同时构建了表达CBS1-413(删除了CBS羧基端调控域138个氨基酸残基)的重组菌E.coli Rosetta(pETDuet-1-CBS1-413),经过一步HisTrap Fast Flow亲和层析,酶活性回收率为74.3%,蛋白质产率为12.8mg/L培养基,纯度达到95%,单位酶活为965U/mg;还表达和纯化了胱硫醚β-裂解酶(CBL),并在此基础上建立了一种新的CBL偶联的CBS酶活性测定方法。; 牛卫宁羊梦林曹珊珊许乐钦传光; 关键词：表达纯化酶活性测定

海藻酸钠明胶协同固定S-腺苷甲硫氨酸合成酶被引量：5: 2013年; 以海藻酸钠和明胶为载体,对S-腺苷甲硫氨酸合成酶进行固定化。再用戊二醛对其进一步交联,增强固定化酶的稳定性。考察了海藻酸钠和明胶质量分数、CaCl2质量分数、酶和载体比例以及交联剂戊二醛体积分数等因素对固定化酶的影响。结果表明,最佳固定化条件为:海藻酸钠质量分数2.0%、明胶质量分数1.0%、CaCl2质量分数4.0%、固定化酶量为2.5 g/L凝胶、戊二醛体积分数0.6%。交联固定化酶热稳定性得到大幅度提高,在50℃下保温5 h仍保留72%的活力,而游离酶则完全失活。交联固定化酶在碱性溶液中的稳定性较高,在pH=8.0～9.0的缓冲液中4℃保温10 h酶活性仍保留87%以上。将交联固定化酶用于S-腺苷甲硫氨酸的合成,连续反应8批次后酶活性仍保留65%。; 尹春丽许乐曹珊珊牛卫宁; 关键词：海藻酸钠明胶固定化 S-腺苷甲硫氨酸合成酶生物工程

氨基树脂固定化S-腺苷甲硫氨酸合成酶的研究被引量：3: 2014年; 以氨基树脂为载体对S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成酶进行固定化,优化了酶的固定化条件并对固定化酶的性质进行了研究。优化的固定化条件为：戊二醛体积分数5%、SAM合成酶添加量20mg·g-1、固定化时间5h。所制备的固定化SAM合成酶的酶活力为476.8U·g-1,酶活力回收率为74.5%。与游离SAM合成酶相比,固定化SAM合成酶的稳定性大幅提高,在50℃孵育5h酶活力仍保留61.2%,而游离SAM合成酶则完全失活;在pH值为6.0-6.5、8.0-9.5的缓冲溶液中,固定化SAM合成酶也更加稳定;固定化SAM合成酶连续催化反应10批次,酶活力保留86.3%;固定化SAM合成酶在4℃储存30d,酶活力保留81.4%。固定化SAM合成酶米氏常数KATPm=0.14mmol·L-1,KLm-Met=0.28mmol·L-1。; 尹春丽曹珊珊许乐陶贵荣牛卫宁; 关键词：S-腺苷甲硫氨酸合成酶氨基树脂固定化酶酶学性质

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许乐