胡勇
- 作品数：11 被引量：39H指数：3
- 供职机构：武汉生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国际科技合作与交流专项项目更多>>
- 相关领域：医药卫生理学生物学农业科学更多>>
- 人凝血因子Ⅷ中试纯化工艺的质量控制被引量：12
- 2013年
- 目的对以PEG沉淀结合离子交换层析制备的人凝血因子Ⅷ(human coagulation factorⅧ,FⅧ)的中试纯化工艺进行全程质量控制。方法收集FⅧ中试纯化工艺的样品,采用凝固法检测FⅧ凝固活性、BCA法检测总蛋白含量,计算比活性;采用免疫浊度法检测白蛋白(albumin,ALB)、IgG、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)及纤维连接蛋白(fibronectin,FNC)含量;采用双抗体夹心ELISA法检测FⅧ及von Willebrand因子(von Willebrand factor,vWF)抗原含量;采用SDS-PAGE及Western blot法分析FⅧ特异性;参考《中国药典》(三部)2010版检测成品中PEG、Tween 80及磷酸三丁酯[tr(in-butyl)phosphate,TNBP]残留量。结果层析去掉了大部分杂蛋白,层析后比活性提高了近20倍,原液比活性达到66.92 IU/mg。PEG沉淀和DEAE层析纯化,基本去除了ALB、IgG、FIB和FNC,仅有少量FⅧ抗原及活性损失,原液主要成分为FⅧ和vWF。DEAE层析洗脱峰样品在相对分子质量约95 000和72 000之间可见一条特异性条带,与FⅧ轻链(相对分子质量80 000)及冻干FⅧ国家标准品条带位置相符。PEG、Tween 80及TNBP残留量均符合《中国药典》(三部)2010版规定的FⅧ质量标准。结论本中试纯化工艺可制备出高纯度、高比活性的FⅧ。
- 李策生周志军胡勇邢延涛李陶敬林连珍彭焱邹光荣
- 关键词：凝血因子纯化
- 人纤溶酶活性动态显色检测方法的建立及验证被引量：3
- 2017年
- 目的建立人纤溶酶(plasmin,Plm)活性的动态显色检测方法,并进行验证。方法用微量滴定板作为载体,将不同活性浓度的Plm(1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 IU/ml)分别与不同浓度的发色底物S-2251(2.0、1.0、0.66、0.33 mg/ml)混匀,连续监测10 min,测定反应体系吸光值变化率(ΔA/min),确定方法的反应参数。同时对方法的选择性、线性范围、定量下限、准确度、精密性、特异性及稳定性进行验证。采用建立的方法检测Plm纯化样品。结果确定定量上限为0.6 IU/ml,底物浓度为0.66 mg/ml;监测5 min时校正标样及质控样品回收率为92.0%~111.8%,定量下限样品回收率为96.5%~118.0%。注射用水、稀释液、尿激酶(Urokinase,UK)、6-氨基己酸(6-Aminocaproic acid,EACA)、人纤溶酶原(plasminogen,Plg)等组分的响应低于定量下限响应的8.22%,并低于内标响应的0.86%,表明该方法具有良好的选择性;线性范围为0.05~0.6 IU/ml,校正标样回收率在96.8%~111.2%之间,R2≥0.99;定量下限为0.05 IU/ml,定量下限处准确度在115.2%~116.2%之间,CV≤5.0%;高、中、低浓度质控样品检测结果准确度在102.3%~111.8%之间;批内CV值≤7.7%,批间CV值≤5.2%;0.5μg/ml UK对Plm活性检测无影响,EACA浓度在0.05~0.2 mol/L之间及Plg浓度低于0.3 mg/ml时对Plm活性检测结果无影响;Plm质控样品复溶后在室温及2~8℃放置1 h不影响检测结果。Plm纯化样品活性回收率为91.84%。结论本方法具有良好的准确度、精密度、特异性及稳定性,可用于工艺样品中Plm活性的检测。
- 岳胜兰周志军彭焱林连珍李陶敬邢延涛汪菲菲李策生胡勇
- 关键词：酶活性
- 不同配方的冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ制品干热法灭活猪细小病毒效果的影响被引量：2
- 2013年
- 目的研究不同配方的冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ制品干热法灭活非脂包膜指示病毒猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)效果的影响。方法取人凝血因子Ⅷ原液,分别加入A、B、C 3种配方(氯化钠浓度为C6 LgTCID50/ml的指示病毒PPV,进行冻干、干热法灭活(100℃30 min),检测残余PPV滴度;用筛选出的最佳配方制备3批人凝血因子Ⅷ半成品,进行冻干和干热法灭活,检测残余PPV滴度,验证PPV灭活效果;按照《中国药典》三部(2010版)人凝血因子Ⅷ的成品检测要求对人凝血因子Ⅷ效价、外观、水分、复溶时间和复溶后外观进行检测。结果在100℃30 min条件下,可有效灭活配方A制备的人凝血因子Ⅷ半成品中的指示病毒PPV,确定配方A为最佳冻干保护剂配方;3批凝血因子Ⅷ经干热灭活后,可使残余PPV滴度下降(4.08±0.02)LgTCID50/0.1 ml,且灭活过程对人凝血因子Ⅷ的生物学活性无明显影响,步骤活性回收率为(91.1±2)%。结论已成功研制出1种冻干保护剂配方,应用干热灭活法对人凝血因子Ⅷ制品中非脂包膜病毒PPV具有较好的灭活效果,该方法与有机溶剂/表面活性剂(solvent/detergent,S/D)法联合去除/灭活病毒,可有效提高人凝血因子Ⅷ产品的安全性。
- 李策生邹莉李陶敬胡勇邢延涛彭焱周雁翔李娟
- 关键词：冷冻干燥猪细小病毒灭活
- 层析法从血浆分离静注人免疫球蛋白及其初步检定被引量：3
- 2013年
- 目的实验尝试采用多步柱层析的工艺取代乙醇低温沉淀的方法,能高效的从血浆中获得IVIG产品。方法通过亲和层析、离子交换一套工艺纯化出IVIG产品,进而按照《中华人民共和国药典》对静注人免疫球蛋白(pH4)及其关键指标进行了检测。在此基础上还采用免疫浊度法等方法,对其纯度和非目的蛋白构成与国际产品进行比较。结果工艺获得IVIG产品的关键性指标检测均达到《中华人民共和国药典》的要求,其质量不低于现有国际同类产品。结论本工艺能以较高回收率获得高质量的IVIG产品。
- 邹炜李策生周志军李陶敬胡勇邢延涛高少阳
- 关键词：静注人免疫球蛋白离子交换层析
- 检测人血浆蛋白α_1-蛋白酶抑制剂活性的弹性蛋白酶动态显色法的优化及其验证被引量：1
- 2015年
- 目的优化检测人血浆蛋白α1-蛋白酶抑制剂（α1-protease inhibitor,α1-PI）活性的弹性蛋白酶动态显色法,并进行验证。方法以微量滴定板为载体,将不同浓度的α1-PI与特定量的猪胰弹性蛋白酶（porcine pancreaselastase,PPE）混合,测定剩余的弹性蛋白酶催化特定底物的强度,判定样品中α1-PI的含量,通过比较不同浓度酶和底物的组合中标准曲线的线性范围,确定最佳反应条件。对优化的动态显色法进行准确度、精密度验证,并确定标准曲线的线性范围。采用优化后的方法对α1-PI制备工艺进行监控,并筛选冻干配方。结果 PPE与底物的浓度选择分别为0.2 U/ml和1.2 mg/ml。该方法检测α1-PI的线性范围在2-14μg/ml之间,r〉0.99。各浓度样品检测结果的CV均〈4%,回收率在99.4%-104-3%之间,准确性较好;同一样品由同一个实验员在同一试验中连续测定6次的CV为1.8%,同一样品由不同的实验员在不同日期内分别测定3次的CV为1.8%,重复性较好。纯化工艺过程中各样品比活均符合《欧洲药典》规定的〉0.7,总回收率为62.9%;筛选出可较好保护α1-PI活性的配方。结论优化后的弹性蛋白酶动态显色法可用于工艺样品中α1-PI活性的检测。
- 周雁翔周志军林连珍彭焱邹莉胡勇邹炜李策生
- 血浆特定蛋白检测在IgG层析法中试纯化工艺中的应用被引量：6
- 2013年
- 目的通过血浆特定蛋白检测，对层析法纯化IgG的中试工艺进行质量控制。方法采用免疫散射比浊法及BNP特定蛋白分析仪及配套试剂，全面检测生产用和中试纯化工艺用原料血浆的组成，建立血浆中白蛋白（albumin，ALB）、IgG、IgA、IgM、补体3（compliment3，C3）、c4、转铁蛋白（transferin，TRF）、α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，AAT）、d2巨球蛋白（alpha2-macroglobin，A2M）、触珠蛋白（haptoglobin，HPT）、α1酸性糖蛋白（alphal-acid glycoprotein，AAG）、铜蓝蛋白（ceruloplasmin，CER）、纤维蛋白原（fibfinogen，FIB）、抗凝血酶Ⅲ（antithrombinⅢ，ATⅢ）、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 18项特定蛋白分布的数据库；对3批中试纯化工艺各步骤中ALB、IgG、IgA、IgM、FIB、AAT的去除情况及IgG回收率进行监测，验证工艺的稳定性；将3批中试纯化工艺制备的原液及成品中IgG含量的检测结果与凯氏定氮法检测结果进行比较，验证免疫散射比浊法的准确度及不同人员重复检测的中间精密度；对中试纯化工艺及低温乙醇法制备的IgG原液的杂质含量及亚类进行比较分析。结果中试纯化工艺用原料混浆中仅TRF、A2M、ATⅢ含量与生产用原料混浆差异有统计学意义（P〈0．05）；中试纯化工艺用原料血浆经A2P亲和层析去除了大部分的ALB、AAT，辛酸盐沉淀去除了剩余的ALB、FIB和IgM，DEAE离子交换纯化去除了IgA和ALB，IgG总回收率高于70％，表明该工艺稳定性好，提高了目标蛋白的得率。中试纯化工艺制备的IgG原液及成品的检测CV值均〈10％，回收率在90％-110％之间，表明该方法准确度及精密度良好；与低温乙醇法制备的IgG原液相比，中试纯化工艺制备的原液杂质含量更低，IgG的亚类分布与所用的原料血浆相似。结论血浆特定蛋白检测在血浆蛋白纯化工艺的监控和优化中具有应用价值。
- 李策生周志军胡勇李陶敬林连珍彭焱高少阳
- 关键词：血浆蛋白免疫比浊法纯化IGG
- 人凝血因子Ⅷ原液生产工艺放大可行性研究被引量：2
- 2014年
- 目的对比3批小试（50g冷沉淀）、3批小规模放大（400g冷沉淀）和3批中试级（5-10 kg冷沉淀）试验结果探讨人凝血因子Ⅷ原液生产工艺放大的可行性。方法 Tris溶液复溶冷沉淀,经聚乙二醇沉淀后,0.3%磷酸三丁酯和1%Tween 80处理6h以灭活脂包膜病毒,然后经DEAE 650M层析纯化。绝大部分杂蛋白和磷酸三丁酯及Tween80随流穿液直接流穿,洗脱峰样品即为人凝血因子Ⅷ原液。结果 3批小试人凝血因子Ⅷ活性回收率分别为30.50%、24.40%和25.60%,平均值26.83%,回收率变异系数8.52%;3批小规模放大回收率分别为19.40%、21.70%和22.00%,平均值21.04%,回收率变异系数5.54%;3批中试级回收率分别为14.50%、16.50%、17.80%,平均值16.27%,回收率变异系数8.34%。结论对比级放大试验各级回收率及变异系数发现,工艺重复性好,放大可行。
- 邢延涛李策生胡勇陈克金李陶敬周志军林连珍邹莉彭焱邓志军
- 关键词：离子交换层析
- 人白细胞介素-18突变体的虚拟筛选及其活性
- 2008年
- 目的筛选合适的人白细胞介素-18(hIL-18)突变体,并检测其活性。方法运用分子模建工具,模建出IL-18受体及IL-18/IL-18R复合物的分子结构,分别虚拟突变IL-18的4个半胱氨酸为另外19种氨基酸,以野生型IL-18为模板进行同源模建,建立其三维结构模型,计算其IL-18/IL-18R复合物三维结构及分子间作用能变化情况,筛选几种突变方案。运用分子生物学技术构建突变体,表达纯化后进行活性检测。结果根据理论预测情况,筛选了12株突变体。突变的质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。突变体蛋白以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后纯度大于90%。纯化的C38Glu、C127Ser等几株突变体在低浓度时,活性轻微上升,与理论预测结果基本相同。结论已成功构建了多株IL-18的突变体,运用生物信息学方法进行先期筛选有助于加快IL-18的突变研究。
- 杨京生喻刚胡勇全家妩
- 关键词：突变体活性
- 不同基础体温的家兔对热原检查结果的影响被引量：11
- 2009年
- 对实验中使用的普通级家兔基础体温进行统计,观察不同基础体温家兔注射血液制品后的升温情况。按照中华人民共和国药典（2005）年版三部的热原检查规定进行测定,将实验家兔基础体温38.0℃-39.6℃分为3组：38.0℃-38.5℃为1组;38.6℃-39.0℃为2组;39.1℃-39.6℃为3组。注射制品后,家兔升温≥0.4℃记为升温家兔,统计升温≥0.4℃的家兔升温百分率并对其进行统计学处理。经卡方检验,升温家兔≥0.4℃的百分率1组与2组、1组与3组有显著性差异（p〈0.05）;2组与3组无显著性差异（p〉0.05）。家兔对热原的敏感性随基础体温的高低而有明显的差异,基础体温偏低的家兔对热原更敏感,其升温幅度大于基础体温偏高的家兔。
- 项庆军李策生胡勇周雁翔杜兵黄时薇
- 关键词：基础体温热原检查
- 酶标板法检测甘油三酯净含量方法的优化、验证及其在人血白蛋白层析纯化工艺中的应用
- 2014年
- 目的优化酶标板法检测甘油三酯（triglyceride,TG）净含量的方法,进行验证,并将其应用于监测人血白蛋白层析纯化工艺中样品的脂类含量,对工艺优化提供指导。方法建立酶标板上快速检测TG含量方法,通过两步酶反应的吸光度值的差值计算TG净含量。确立该方法的标准曲线范围,并进行准确度和精密度进行验证。采用该方法监测层析工艺中样品的TG净含量,优化人血白蛋白层析纯化工艺。结果该方法检测TG的线性范围在78-2500μg/ml之间,游离甘油（free glycerin,FG）的线性范围在8.13-260μg/ml之间,R2均为0.997。各样品检测结果 CV均〈4%,回收率在102%-107%之间,准确度较好;同一样品由同一个实验员在同一试验中连续测定6次和由不同的实验员在不同日期内分别测定3次的结果,CV均〈3%,精密度较好。在人血白蛋白层析纯化工艺中采用去脂剂可将白蛋白样品中的残余脂类去除。结论优化后的甘油三酯净含量检测方法为人血白蛋白层析纯化工艺的优化提供了指导,在血液制品工艺研发过程中具有重要的应用价值。
- 周志军李陶敬邹炜胡勇李策生
- 关键词：血浆蛋白甘油三酯
