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7-木糖紫杉烷糖基水解酶Lxyl-p1-2基因突变库与高通量筛选体系的构建: 对7-木糖紫杉烷糖基水解酶Lxyl-p1-2基因进行定向进化的初步研究,确定易错PCR条件、优化克隆连接方法、建立基于48微孔板高通量筛选模型.利用易错PCR技术对Lxyl-p1-2基因进行随机突变,比较不同浓度Mg2+...; 李慧仙朱平; 关键词：易错PCR

7-木糖紫杉烷糖基水解酶Lxyl-p1-2基因突变库与高通量筛选体系的构建: 2013年; 对7－木糖紫杉烷糖基水解酶Lxyl－p1－2基因进行定向进化的初步研究，确定易错PCR条件、优化克隆连接方法、建立基于48微孔板高通量筛选模型。利用易错PCR技术对Lxyl－pl－2基因进行随机突变，比较不同浓度M聋’进行易错PCR，每组随机挑取10个克隆进行测序。序列分析表明：在M聋’浓度为7mmol／L条件下，碱基平均突变率为0．12％，即对于Lxyl－p1－2基因（2．4kb）来说，每个基因序列平均有3个碱基突变，达到构建突变文库的频率要求，选择该条件作为易错PCR条件。利用in-fusion技术将Lxyl－p1－2突变基因克隆到pPIC3．5K载体中，获得大量重组突变质粒。该研究优化了in-fusion连接反应中基因片段和载体片段的摩尔比，并探讨了基因片段与载体片段问同源序列长度对in—fusion连接效率的影响。试验结果表明：基因片段与载体片段的摩尔比最佳梯度为5：1；同源序列长度的选择成为影响in—fusion连接效率的关键因素之一。当同源序列长度为100bp时连接效率达到最大值，且显著高于同源序列长度为15～50bp的连接效率，此时阳性重组率提高至90％左右。与常规酶切一连接法相比，in-fusion法具有明显优势，同时将克隆周期由3～4d缩短为1～2d。挑取单菌落，在48微孔培养板上进行培养、诱导表达2d后，取菌液进行酶活测定（底物PNP-Xyl）。以野生型为例，β-木糖苷酶的酶活013405均数μ=3．415，其数据组标准差为δ=±0．078，数值符合正态分布的原理，建立统计学野生型均数分布范围和48微孔板高通量筛选，为后续突变体筛选提供基础。; 李慧仙朱平; 关键词：易错PCR

具有β‑木糖苷酶和β‑葡萄糖苷酶双重活性的糖基水解酶突变体及其应用: 本发明提供了一系列糖基水解酶LXYL‑P1突变体蛋白，这些突变体蛋白具有β‑木糖苷酶和/或β‑葡萄糖苷酶活性，均能专一性地从7‑木糖紫杉烷类化合物上水解去除木糖基，本发明涉及这些突变体的氨基酸序列以及编码这些氨基酸序列的...; 朱平梁潇王芬李慧仙陈天娇; 文献传递

同源区段长度对In-Fusion技术连接效率的影响被引量：5: 2013年; 目的在目的基因原载体（DNA 模板）与克隆载体相同的条件下，探讨了 PCR 扩增片段（含目的基因）的末端与载体间同源区段长度对 In-Fusion 连接效率的影响，并建立以In-Fusion 技术为基础的高通量克隆方法。方法以糖基水解酶 Lxyl-p1-2（2.4 kb）基因突变库的构建为例，设计引物使目的基因的两端分别与线性化载体末端含有15~200 bp 重叠序列，并通过易错 PCR 方法获得含目的基因的 PCR 扩增片段，运用 In-Fusion 技术将 PCR 扩增片段定向克隆至表达载体 pPIC3.5K 中。结果对于长度大约为2.4 kb 的较大片段 DNA 的克隆， PCR 扩增片段的末端与载体间最适同源区段长度约为100 bp，此时连接效率最高，其阳性重组率高达90%左右，是常规酶切连接法的3倍。与后者相比，该技术将克隆周期由3~4 d 缩短为1~2 d。结论优化的同源区段长度可以显著提高 In-Fusion 技术对于2.4 kb 目的基因与载体的连接效率，该方法尤其适用于定向进化过程中基因突变库的构建。; 李慧仙朱平; 关键词：高通量克隆

具有β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶双重活性的糖基水解酶突变体及其应用: 本发明提供了一系列糖基水解酶LXYL‑P1突变体蛋白，这些突变体蛋白具有β‑木糖苷酶和/或β‑葡萄糖苷酶活性，均能专一性地从7‑木糖紫杉烷类化合物上水解去除木糖基，本发明涉及这些突变体的氨基酸序列以及编码这些氨基酸序列的...; 朱平梁潇王芬李慧仙陈天娇; 文献传递

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李慧仙

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