该研究通过慢病毒感染的方式构建携带T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3及可结晶区域[T cell immunoglobulin and mucin domain 3 and fragment of crystallizable,TIM-3(Fc)]目的基因的稳定转染细胞株并检测TIM-3(Fc)分泌蛋白的表达。设计特异性引物PCR扩增TIM-3(Fc)片段,重组插入慢病毒表达载体pCD513中并鉴定阳性克隆,无内毒素提取质粒pCD513-TIM-3(Fc)、pSPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,再利用慢病毒感染悬浮HEK293细胞,最后通过嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株293/TIM-3。再通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测TIM-3(Fc)目的基因在转录和翻译水平上的表达,用时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)检测细胞产生TIM-3(Fc)分泌蛋白的能力。成功构建了pCD513-TIM-3(Fc)慢病毒表达载体,qRT-PCR、WB和TRFIA检测表明,293/TIM-3细胞株成功表达了TIM-3(Fc)分泌蛋白。成功构建了重组人可溶性TIM-3稳定转染细胞株293/TIM-3并成功表达了TIM-3(Fc)分泌蛋白,为进一步研究可溶性TIM-3蛋白的生物学功能提供基础。
