张会
- 作品数：22 被引量：47H指数：5
- 供职机构：东北农业大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划黑龙江省自然科学基金黑龙江省高等教育教学改革工程项目更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程农业科学更多>>
- 白曲霉酸性蛋白酶在黑曲霉中表达被引量：7
- 2016年
- 研究分析固态发酵酸性蛋白酶生产菌株及其产品,ITS序列鉴定结果表明,该菌株为曲霉属,质谱分析结果表明其产品为Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I（EC.3.4.23.18）。根据Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I基因序列pep1（GI：473517）设计引物,以固态发酵酸性蛋白酶生产菌株基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增获得pep1基因。序列分析结果表明,扩增片段与白曲霉Aspergillus kawachii酸性蛋白酶基因组序列相似性为99%,其编码蛋白与白曲霉Aspergillus kawachii酸性蛋白酶（GAA90749.1）相似性为100%,将该基因命名为pep B。构建黑曲霉表达载体p SZHG-pep B,通过农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462,筛选得到在gla A位点发生同源重组纯合转化子。经摇瓶发酵后,对产物进行SDS-PAGE、酶活检测以及酸性蛋白酶酶学性质和酶稳定性研究。结果表明,纯合同源重组菌株经SDS-PAGE检测时在47 ku左右处有明显目的蛋白条带,其发酵产物酸性蛋白酶酶活达5 543 U·m L-1,为出发菌株152倍。对菌株所产酸性蛋白酶酶学性质研究发现,该酶最适反应温度为50℃,最适反应p H 3.0,在4℃和25℃条件下,酶在p H 3.0~4.0时较稳定。
- 李杰吴婷马南王欣杨建乐李健友张会
- 关键词：酸性蛋白酶黑曲霉同源重组分泌表达
- 单宁酶基因在黑曲霉中的同源表达被引量：1
- 2014年
- 利用PCR方法从黑曲霉基因组中扩增单宁酶基因的编码区，构建其黑曲霉表达载体pSZH-tan。通过农杆菌介导法将TAN基因导入黑曲霉中，经筛选获得将TNA基因整合到糖化酶基因的同源重组转化子。对转化子表达产物进行SDS-PAGE分析和酶活检测，结果表明，重组蛋白分子质量约为76 ku，重组菌株单宁酶表达量为322~581μg·mL^-1，最高发酵酶活为41.12 U·mL^-1。
- 李杰岳苗苗江连洲韦素真姚杨张会
- 关键词：单宁酶黑曲霉基因置换
- 构建β-甘露聚糖酶的黑曲霉工程菌被引量：4
- 2013年
- 目的:在黑曲霉CICC2462中表达经过改造的β-甘露聚糖酶基因(MAN)。方法:从黑曲霉CICC2462中扩增得到MAN(1 275bp),并针对黑曲霉CICC2462中高表达的糖化酶基因(glaA)位点,通过重叠延伸PCR将MAN基因片段与glaA的5’、3’同源臂进行拼接得到同源重组表达框GMG,将其定向插入表达载体pSZH-CYM中,构建黑曲霉表达载体pSZH-MAN,进而通过农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462。结果:经筛选获得4株重组菌株,并从中筛选出在glaA位点发生基因置换的同源重组菌株1株。对4株重组菌株的发酵液上清液进行酶活测定,结果表明MAN基因在黑曲霉中得到了分泌表达,静置培养8d后其分泌表达的β-甘露聚糖酶酶活最高可达12 467.2U/mL,而在出发菌株最高仅可达171.4U/mL,重组菌株是出发菌株的72倍。结论:此研究为简化β-甘露聚糖酶发酵生产工艺、提高产量提供了新的途径。
- 张莹莹张会李杰
- 关键词：Β-甘露聚糖酶黑曲霉基因置换农杆菌同源重组
- β-1,4-内切木聚糖酶基因在黑曲霉中安全高效表达的研究
- 丝状真菌具有卓越的表达和分泌能力，以及与哺乳动物相似的糖基化修饰系统，其安全性也广泛为人们所接受，是表达真核基因的理想系统。目前，在世界范围内研究和开发丝状真菌表达系统已成为重组酶制剂研究领域的热点。尽管目前国内利用木霉...
- 张会
- 关键词：黑曲霉内切木聚糖酶分泌表达
- 文献传递
- 高产高纯度果胶甲酯酶黑曲霉工程菌的构建被引量：1
- 2021年
- 为获得一株高产高纯度的果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌,提高果胶甲酯酶的产量,从果胶酶生产菌种中克隆了果胶甲酯酶基因pmeA,通过同源重组的原理,冻融法转化农杆菌、农杆菌介导法转化黑曲霉方法,成功构建了分泌表达果胶甲酯酶的纯合重组菌株TH-2(glaA::pmeA)。基本发酵培养基中发酵第9 d上清中最高酶活达到467.77 U/mL。进一步敲除重组菌株TH-2(glaA::pmeA)中背景蛋白酸稳定的α-淀粉酶的编码基因asaA,获得纯合重组菌株TH-2(glaA::pmeAΔpyrGΔasaA)。该菌株在添加1%的硫酸铵的发酵培养基中培养7 d后,发酵液上清中主要的背景蛋白均消失。但是与纯合重组菌株TH-2(glaA::pmeA)相比,果胶甲酯酶表达量有所下降,最高酶活为255.40 U/mL。重组果胶甲酯酶的最适作用温度为50℃,适合的温度范围是40~80℃,在80℃下仍能维持其酶活性的70%以上,适合的pH范围是3.0~5.0,最适pH为4.0。最终获得了一株温度和pH作用范围较宽的高产高纯度果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌。
- 韩萌萌盖金明姜庆丰张会李杰
- 关键词：果胶甲酯酶黑曲霉分泌表达
- 天门冬酰胺酶基因在黑曲霉中的同源表达被引量：1
- 2015年
- 根据NCBI中的黑曲霉天门冬酰胺酶基因asp序列（GI：145231287）设计特异性引物,从黑曲霉CICC2462基因组中扩增asp基因编码区,构建其黑曲霉表达载体p SZHG-Asp。通过农杆菌介导法转化黑曲霉,筛选以asp基因置换糖化酶基因gla A的同源重组转化子。对转化子的表达产物进行SDS-PAGE分析和酶活检测。获得8株在gla A位点发生基因置换的同源重组转化子,并对其中4株的上清液进行检测。SDS-PAGE结果显示,在42 000处有目的蛋白质条带,重组菌株的目的蛋白质表达量为185~417μg/m L,发酵液最高酶活为21 111 U/m L。
- 韦素真张会姚杨岳苗苗李杰
- 关键词：黑曲霉基因置换
- 正调控元件拷贝数对黑曲霉PglaA启动子的影响
- 2019年
- 为获得转录水平更高的强启动子,提高黑曲霉中重组蛋白表达量,研究在黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因启动子PglaA基础上,构建分别含2、4、6个拷贝的正调控元件片段PglaA2R、PglaA4R、PglaA6R启动子。以黑曲霉木聚糖酶基因xynB为目的基因,研究正调控元件拷贝数对PglaA启动子的影响。构建黑曲霉表达载体pSZHG2R-xynB、pSZHG4R-xynB、pSZHG6R-xynB,采用农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462。获得目的基因表达框整合在葡萄糖淀粉酶基因位点的纯合黑曲霉重组菌株PglaA2R-xynB、PglaA4R-xynB、PglaA6R-xynB。经SDS-PAGE检测观察到重组菌株分泌约24.0ku木聚糖酶蛋白条带。经酶活检测表明,木聚糖酶活力在第8天达最高,重组菌株PglaA4R-xynB(7705.36U mL^-1)、PglaA6R-xynB(8466.32U mL^-1)比PglaA2R-xynB(5890.77U mL^-1)分别提高1.31倍和1.44倍。荧光定量PCR结果表明,重组菌株PglaA4R-xynB、PglaA6R-xynB的xynB基因mRNA比PglaA2R-xynB分别提高2.2倍和5.3倍。可知,PglaA启动子正调控元件多拷贝显著提高木聚糖酶表达。
- 李杰丁纯洁鄢健楠安欣刘天奇张会
- 关键词：黑曲霉启动子多拷贝木聚糖酶
- 内切葡聚糖酶基因在黑曲霉中的同源表达被引量：5
- 2014年
- 内切葡聚糖酶作用于纤维素的非结晶区,随机水解β-1,4-糖苷键,将长链的纤维素截断,对纤维素的整体降解起重要作用。研究从黑曲霉CICC2462中扩增得到内切葡聚糖酶基因Eng1,并针对黑曲霉中高表达的糖化酶基因glaA位点,构建Eng1基因表达载体pSZHG-Eng1,进一步通过农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得2株在glaA基因位点发生基因置换的同源重组转化子。在摇瓶发酵条件下,发酵液上清中的内切葡聚糖酶活力最高可达到272 U·mL-1,是出发菌株5.2倍。SDS-PAGE分析显示,两株重组菌株都有约36 ku目的蛋白条带,表达量为165~193μg·mL-1。结果表明,研究实现内切葡聚糖酶在黑曲霉中的同源表达,可为食品级内切葡聚糖酶的大规模工业化生产奠定基础。
- 李杰高博江连洲刘君邓晨旭陈璐璐张会
- 关键词：内切葡聚糖酶黑曲霉同源重组
- 食品级木聚糖酶黑曲霉工程菌的构建被引量：19
- 2013年
- 从黑曲霉CICC2462中扩增得到木聚糖酶基因xynB的成熟肽编码序列(746 bp),并针对黑曲霉CICC2462中高表达的糖化酶基因位点,通过重叠延伸PCR将xynB基因片段与糖化酶基因的5'同源臂、3'同源臂进行拼接得到同源重组表达框GBG,将其定向插入表达载体pSZH-CYM中,构建黑曲霉表达载体pSZH-xynB。将载体pSZH-xynB通过冻融法转化农杆菌AGL1,通过农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462菌丝体。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得47株重组菌株,并从其中12株中筛选出在糖化酶基因位点发生基因置换的同源重组菌株9株。而后通过连续传代、筛选和PCR检测,获得消除潮霉素基因的纯合的同源重组菌株,获得符合食品级生产要求的工程菌。对工程菌进行发酵培养、酶活性检测和SDS-PAGE分析,表明在糖化酶摇瓶发酵条件下,工程菌培养液上清的木聚糖酶活性高达4 495.8975 U·mL-1。研究结果为生产低木糖苷酶活性的内切木聚糖酶提供新途径,为利用黑曲霉表达系统安全高效地生产其他酶制剂和重组蛋白提供参考。
- 李杰张会张莹莹双宝王多佳赵宁李勇赫福霞
- 关键词：木聚糖酶黑曲霉同源重组根癌农杆菌
- 凤尾菇(Pleurotus sajor-caju)漆酶Lac4基因在黑曲霉中表达研究被引量：7
- 2017年
- 研究将凤尾菇漆酶基因Lac4(Gene Bank登录号AJ507327.1)cDNA克隆到表达载体pSZHG10-6-2上,通过农杆菌介导法导入黑曲霉CICC2462中,筛选得到糖化酶基因glaA位点发生同源重组的黑曲霉转化子。摇瓶发酵后取上清液作SDS-PAGE检测、酶活测定及酶学性质和酶稳定性分析,研究重组漆酶对染料脱色影响。结果表明,成功分泌表达重组漆酶r Lac4,其活性在第9天时达酶活最高峰1 211 U·L^(-1);酶学性质研究发现,其最适反应温度为60℃、pH为4.5,且在10~30℃及pH 5.0~6.0稳定性较好。最适反应条件下,重组漆酶对ABTS的Km为0.142 mmol·L^(-1),最大反应速率Vm为0.693 mmol·L^(-1)·min^(-1)·mg^(-1);通过重组漆酶研究4大类染料脱色能力,发现ABTS为介体时该漆酶对三苯基甲烷类孔雀绿脱色可达44%,杂环类中性红、偶氮类甲基橙脱色率分别13%和11%,而对蒽醌类活性亮蓝(RBBR)降解作用不明显,重组漆酶对孔雀绿的脱色效率具有较大应用价值潜力,对含三苯基甲烷染料废水处理应用前景良好。
- 李杰李双于盛竹刘欢欢张会
- 关键词：漆酶黑曲霉异源表达酶学性质
