刘雷山
- 作品数：11 被引量：53H指数：5
- 供职机构：长沙市第四医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广州市科技攻关项目广东省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 家蝇抗菌肽Defensin基因在COS-7细胞中的瞬时表达被引量：6
- 2006年
- 目的:研究家蝇抗菌肽Defensin cDNA在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达情况,并对表达产物的抗菌作用进行初步检测。方法:以Defensin基因为模板设计特异性引物,扩增在C端含6×His标签的Defensin开放阅读框序列,将此序列与真核表达载体pcDNA3.1(+)进行重组,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/Defensin-His 6。以阳离子脂质体LipofectamineTM2000为载体,对宿主细胞COS-7进行重组质粒pcDNA3.1(+)/Defensin-His 6和空载体pcDNA3.1(+)的转染,72h后收集细胞培养上清液,表达产物经His-Trap HP亲合层析柱分离纯化和Western blotting鉴定后,进行杀菌活性的初步检测。结果:重组质粒pcDNA3.1(+)/Defensin-His 6组细胞培养上清液的纯化物,行Western blotting得到了分子量大小约为10.0kD的单一目的条带,与预期相符;杀菌活性试验中发现:该纯化物对大肠杆菌E.coliK12D31具有一定的杀菌活性。结论:家蝇抗菌肽Defensin基因在宿主细胞COS-7中得到了正确表达。
- 金小宝朱家勇马艳刘雷山
- 关键词：天蚕素真核表达转染杀菌活性
- 家蝇抗菌肽基因Cecropin在COS-7细胞中的表达及产物活性初步研究被引量：14
- 2007年
- 目的初步研究家蝇抗菌肽Cecropin cDNA在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达及其产物的抗菌作用。方法以Cecropin基因为模板设计2条特异引物,扩增在C端含6×His标签的Cecropin开放阅读框序列,将此序列与真核表达载体pcDNA3.1(+)进行重组,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/Cecropin-His_6。以脂质体LipofectamineTM2000为载体,对COS-7细胞进行重组质粒pcDNA3.1(+)/Cecropin-His_6和空载体pcDNA3.1(+)的转染,72h后收集细胞培养上清液,表达产物经His-TrapHP亲合层析柱分离纯化和Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定后,进行杀菌活性的初步检测。结果转染了重组质粒pcDNA3.1(+)/Cecropin-His_6细胞培养上清液的纯化物,行Tricine-SDS-PAGE电泳得到与预期分子量大小相符的单一目的条带,该纯化物对大肠杆菌E.coli K12D31具有一定的杀菌活性。结论家蝇抗菌肽Cecropin cDNA在COS-7中得到了正确表达。
- 金小宝朱家勇马艳刘雷山
- 关键词：天蚕素真核表达转染杀菌活性
- 家蝇抗菌肽Defensin基因同向串联表达载体的构建和鉴定被引量：12
- 2006年
- 目的:构建家蝇抗菌肽Defensin基因多拷贝串联体,并克隆到甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K上。方法:PCR法扩增家蝇抗菌肽Defensin基因成熟肽片断,目的片断的上游5′端带有EcoRⅠ和NheⅠ位点,下游5′端带有NotⅠ和XbaⅠ位点,目的片断首先克隆入pMD18-T载体,利用pMD18-T载体的NdeⅠ位点和目的片断上的一对同尾酶(NheⅠ和XbaⅠ),多次酶切连接,串联成多拷贝的Defensin成熟肽基因,再用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,最后克隆入甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K。结果:PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证明多拷贝基因重组质粒构建成功。结论:该方法能方便高效地获得所需的多拷贝基因,为进一步进行高效表达打下基础。
- 王婷婷金小宝朱家勇刘雷山
- 关键词：家蝇抗菌肽多拷贝
- 筛选家蝇抗菌肽相关基因的oligo探针设计
- 2008年
- 目的设计筛选家蝇抗菌肽相关基因的寡核苷酸(oligonucleotide)探针。方法用生物学软件ArrayDesig-ner2.0,结合NCBI开发的免费生物信息学软件,对GenBank数据库中部分昆虫抗菌肽基因编码区保守序列设计特异性高、Tm值接近、长度均一的oligo探针。结果共设计出372条oligo探针,长度为50bp,GC含量为40%～60%,Tm为70～75℃。结论用GenBank数据库资源,结合生物学软件Array Designer2.0及NCBI中相关生物信息学软件能快速而有效地设计出筛选家蝇抗菌肽基因的探针。
- 刘雷山朱家勇金小宝李源湘龚建武
- 关键词：寡核苷酸探针生物信息学
- 家蝇幼虫抗菌肽天蚕素基因的克隆及其在大肠杆菌中融合表达(英文)被引量：8
- 2007年
- 目的从家蝇三龄幼虫中提取总RNA,先利用RT-PCR扩增编码天蚕素Cecropin的cDNA序列,克隆入T载体pUCm-T并测定其序列。然后以pUCm-T/Cecropin为模板,通过PCR方法扩增Cecropin成熟肽cDNA序列,并将该序列的N-端大肠杆菌稀有密码子GGA点突变为GGC,C-端终止密码子TAA前加进一个天冬酰胺(Asn)密码子AAC,命名为mCecropin。mCecropin基因序列克隆至融合表达载体pGEX-4T-1中。酶切分析和测序鉴定后,将阳性重组子质粒转入不同的大肠杆菌宿主细胞中进行融合表达。经SDS-PAGE分析,选用E.coliBL21(DE3)作为表达宿主菌。表达的融合蛋白GST-mCecropin通过GSTrap亲合柱纯化后用凝血酶酶切GST标签,mCecropin经HiTrap柱进一步纯化后,具有较强的抗菌活性。
- 徐建华朱家勇金小宝许琴英刘雷山马艳王艳
- 关键词：家蝇天蚕素抗菌肽基因克隆
- 家蝇抗菌肽及其基因的克隆进展被引量：4
- 2007年
- 家蝇抗菌肽是一类由结构基因编码的小分子肽类物质,是构成其自身防御体系的重要组分,具有广谱的抗菌、抗病毒、抑肿瘤细胞等生物活性,已引起人们的广泛关注。文中主要介绍家蝇抗菌肽的产生、结构特点、生物学功能及其基因的克隆进展。
- 刘雷山金小宝朱家勇
- 关键词：家蝇抗菌肽基因克隆
- 顺式串联家蝇抗菌肽Attacin基因真核表达载体的构建被引量：6
- 2006年
- 目的构建家蝇抗菌肽Attacin基因多拷贝串联体,并克隆到甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K上。方法PCR法扩增家蝇抗菌肽Attacin基因成熟肽片断,目的片断的上游5′端带有EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ位点,下游5′端带有NotⅠ和xbaⅠ位点,目的片断首先克隆入pMD18-T栽体,利用pMD18-T载体的Nde Ⅰ位点和目的片断上的一对同尾酶(Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ),多次酶切连接,串联成多拷贝的Attacin成熟肽基因,再用EcoRⅠ和Not Ⅰ双酶切,最后克隆入甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K。结果 PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证明串联体基因重组质粒构建成功。结论该方法能方便高效地获得所需的多拷贝基因,为进一步进行高效表达打下基础。
- 王婷婷金小宝朱家勇刘雷山
- 关键词：家蝇抗菌肽多拷贝
- BPI_(23)-haFGF融合蛋白的鉴定及其生物活性研究被引量：1
- 2008年
- 目的研究BPI23-haFGF融合蛋白的生物学活性。方法将已构建的酵母重组表达菌株pPICZαA-BPI23-haF-GF/X-33进行甲醇诱导表达,通过亲和层析纯化和冻干浓缩后,观察融合蛋白BPI23-haFGF对细菌、NIH3T3细胞以及小鼠烫伤模型的作用。结果获得纯度约90%的融合蛋白BPI23-haFGF,BPI23-haFGF具有杀菌及促增殖的双重功能,BPI23-haFGF促增殖率与HaFGF标准品相当,当其浓度为0.40g/L时,促NIH3T3细胞增殖率最高(88.7%);在小鼠烫伤模型中,用药组比阴性对照组提前2～3d愈合。结论融合蛋白BPI23-haFGF能够改善小鼠烫伤创面的愈合,为其在临床上的应用奠定了基础。
- 马艳朱家勇金小宝刘雷山王艳李娟兰
- 关键词：杀菌促增殖烫伤愈合
- 基因芯片技术筛选家蝇抗菌肽相关基因被引量：2
- 2008年
- 用生物学软件对GenBank中部分昆虫抗菌肽基因编码区保守域设计探针,用直接点样法将探针点印在特制玻片上构建寡核苷酸(Oligonucleotide,oligo)探针微阵列;提取诱导后24h的家蝇三龄幼虫脂肪体总RNA,逆转录成cDNA并标记上荧光标记物Cy3,与构建的oligo探针微阵列杂交,经洗片、扫描处理后进行数据分析。结果在两次重复实验中均检测到有效杂交信号的基因点有15个(不包括阳性对照基因),为进一步发现其新基因提供了依据。
- 刘雷山金小宝朱家勇肖平李沅湘龚建武
- 关键词：基因芯片家蝇抗菌肽基因
- 基因芯片技术在新基因发现中的应用被引量：5
- 2007年
- 基因芯片技术是20世纪90年代中期在生命科学领域中发展起来的一种分子生物学新兴技术,是多学科的交叉融合。简要概述了基因芯片技术的产生、原理、特点、制作方法和类型,及其在新基因发现中的应用。
- 刘雷山金小宝朱家勇
- 关键词：基因芯片新基因
