金秋
- 作品数：10 被引量：20H指数：3
- 供职机构：江苏省疾病预防控制中心更多>>
- 发文基金：江苏省自然科学基金江苏省卫生厅科研基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及初步应用被引量：11
- 2012年
- 目的制备发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)核衣壳蛋白(NP)的单克隆抗体,并探讨其在该病诊断中的作用。方法克隆NP基因,构建原核表达载体pComb3XSS-NP,并转化大肠杆菌Top10F′,经诱导表达,纯化获得6HIS-NP融合蛋白。以该融合蛋白免疫Balb/c小鼠,经杂交瘤技术制备NP的鼠源单克隆抗体。经鉴定后,选择1株1C8-C6进行大量制备、纯化,并偶联辣根过氧化物酶(HRP),用该酶标抗体对SFTSV感染人的急性期血清进行Western blot检测。结果成功表达、纯化SFTSV重组的NP。经小鼠免疫、细胞融合和ELISA筛选后,共获得4株鼠源单克隆抗体。具较高滴度的1C8-C6酶标抗体能与SFTSV感染人的急性期血清中的NP在Western blot水平上结合,而与汉坦病毒、登革热病毒感染人急性期血清及正常人血清不反应。结论 SFTSV NP的表达及其单抗的制备为该病的实验室诊断奠定了基础。
- 徐言曾晓燕焦永军张国强张黎罗兰金秋张建平史智扬
- 全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定被引量：5
- 2013年
- 目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性。方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库。以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性。结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0×107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv。经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体。经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg。结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础。
- 张倩倩赵茜张晓丁贵鹏金秋高畅熊四平陈玉平朱进冯振卿
- 关键词：噬菌体抗体库中和活性
- 抗Ⅱ型志贺毒素人鼠嵌合抗体IgG真核表达及鉴定
- 肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagie Escherichia coli, EHEC) O157:H7自1982年被确认为致病菌以来的20多年中,其引发的食物中毒在世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。E...
- 金秋
- 肠道病毒71型重组VP1蛋白的原核表达及初步鉴定
- 2012年
- 目的利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71VP1全长基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体pET28a(+),构建表达质粒pET28a(+)/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,利用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经ELISA和Western Blot,验证EV71VP1的抗原性。结果成功构建pET28a(+)/VP1重组质粒,经大肠杆菌表达、纯化获得分子量约为43kDa的融合蛋白,经ELISA和Western Blot,结果显示该蛋白有良好的抗原性。结论实现了肠道病毒7l型VP1蛋白的原核高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。
- 张黎包林金秋黄明明曾晓燕郭喜玲李祥瑞焦永军
- 关键词：肠道病毒71原核表达
- 高尔基蛋白73(GP73)ELISA定量检测方法的建立及临床应用
- 2013年
- 目的建立双抗体夹心ELISA定量检测人血清高尔基蛋白73(GP73)的方法,并用于检测血清GP73含量。方法利用杂交瘤法制备纯化的抗GP73单克隆抗体(mAb)进行辣根过氧化物酶(HRP)标记后,通过棋盘滴定法确定包被抗体和酶标抗体及其最适工作浓度;以重组人的GP73抗原为标准品建立标准曲线;以重复性、灵敏性和回收率实验评价ELISA方法。应用该ELISA法对正常人、肝炎、肝硬化及肝癌患者血清中的GP73水平进行定量检测。结果当抗GP73 mAb3D5A10和7H3F5分别为捕获抗体和酶标抗体、工作浓度分别为40μg/ml和1∶4000时,双抗体夹心ELISA法最优。该方法的平均批内和批间变异系数分别为4.6%和7.6%,灵敏度达3.76ng/ml,平均回收率为(102.2±5)%。用本方法重复测定肝癌(33例)、肝硬化(28例)、乙型肝炎(44例)及正常人(44例)血清样本中GP73浓度(中位数)分别为25.9、27.6、16.7、9.9μg/L;除肝癌与肝硬化组间差异无统计学意义外,其余各组间均有统计学差异(P<0.05)。结论成功建立了双抗体夹心ELISA定量检测GP73的方法。检测血清GP73可作为诊断肝脏疾病的重要辅助手段之一。
- 周云包林徐言金秋张黎张建平焦永军
- 关键词：原发性肝癌双抗体夹心ELISA
- 抗人结缔组织因子人源单链抗体的筛选、表达及活性鉴定
- 2013年
- 目的从人源噬菌体抗体文库中筛选抗人结缔组织生长因子(CTGF)单链抗体(ScFv),原核表达并鉴定其活性。方法以重组人源CTGF(rhCTGF)为靶标,对人源噬菌体抗体文库进行筛选;用Phage-ELISA筛选阳性克隆并进行原核表达、纯化,获得了高纯度的ScFv蛋白,通过ELISA和Millicell迁移实验鉴定其活性。结果经过3轮筛选,获得1株特异性抗人CTGF ScFv 1C5,ELISA显示1C5能与rhCTGF特异性结合;在Millicell迁移实验中,1C5能抑制CTGF的生物学功能,具有中和活性。结论成功筛选到1株抗人CTGF的ScFv,有望在CTGF相关疾病的治疗上发挥作用。
- 周云包林金秋张黎蔡雪婷卢悟广曹鹏焦永军张建平
- 关键词：结缔组织生长因子噬菌体展示技术单链抗体靶向治疗
- Ⅱ型志贺毒素单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的表达和功能鉴定
- 2010年
- 目的从分泌抗肠出血性大肠埃希菌Ⅱ型志贺毒素中和单克隆抗体杂交瘤细胞株S2C4中克隆抗体可变区基因，构建单链抗体（ScFv），进行原核表达，并对其功能进行鉴定。方法从杂交瘤细胞株S2C4中提取总RNA，逆转录成cDNA。在cDNA3’-OH末端添加poly．G。PCR扩增包括5’非翻译区和信号肽序列在内的抗体重、轻链可变区基因VH和VL,PCR产物装入T—A载体测序。根据测序结果，设计引物分别扩增VH和VL编码区，再通过重叠PCR，在VH和VL．编码区基因之间引入连接链，构建Scn基因，并克隆到表达载体pComb3xSS中。重组载体导入E．coliTop10F’进行表达，重组蛋白经纯化后，分别用ELISA和动物保护性实验鉴定其生物学活性。结果VH和VL编码区基因全长分别为396bp和378bp，ScFv基因能在大肠埃希菌中高效表达，表达产物的分子量为34000，用NiSO4亲和层析柱成功纯化。功能性实验表明纯化的重组蛋白可以与Stx2毒素有效结合，能保护动物抵御毒素分子的攻击。结论成功地克隆S2C4单抗可变区基因，并构建、表达其单链抗体ScFv，为下一步进行该抗体人源化奠定实验基础。
- 郭喜玲吴涛曾晓燕张晓陈银史智扬詹峰金秋焦永军
- 关键词：单克隆抗体单链抗体
- 人高尔基体蛋白GP73基因的克隆、表达、单克隆抗体的制备及鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的:高尔基体蛋白73(Golgi protein 73,GP73)是新近发现的肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要血清学标志物。通过克隆、表达人GP73,制备抗GP73单克隆抗体并鉴定其特性。方法:克隆GP73基因,构建GP73原核表达载体pComb3XSS-GP73,诱导表达,以HisFF Trap亲和层析柱纯化GP73-6×His重组融合蛋白。以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗GP73单克隆抗体。以间接法ELISA检测抗体效价;Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法初步检测肝癌患者血清中GP73表达水平。结果:成功表达并纯化了GP73-6×His重组蛋白;获得5株稳定分泌抗人GP73单克隆抗体杂交瘤细胞株;免疫共沉淀证实抗GP73单克隆抗体能与肝癌患者血清中GP73蛋白特异性结合,GP73水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高。结论:成功制备了抗人GP73单克隆抗体,为后期建立检测人GP73的双抗体夹心ELISA方法打下基础。
- 徐言曾晓燕张晓金秋张建平焦永军
- 关键词：GP73单克隆抗体肝细胞性肝癌肿瘤标志物
- H5N1型禽流感病毒广谱中和单克隆抗体的筛选及其中和机制初步研究被引量：3
- 2011年
- 利用杆状病毒-昆虫细胞表达H5N1型禽流感病毒的血凝素蛋白(HA),纯化后的重组蛋白HA免疫小鼠并制备杂交瘤单克隆抗体,用H5N1型禽流感病毒的全病毒进行筛选,成功地获得了抗H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA的单抗.MDCK细胞微量中和试验表明,单抗8G10D7可对clade2和clade9的H5N1型禽流感病毒起中和作用.Western-blot及血凝抑制实验进一步证明了该单抗的结合位点位于HA蛋白的HA1亚基上.鸡胚感染病毒预防试验结果表明,8G10D7对禽来源的和人来源的H5N1型禽流感病毒均可达到100%的保护率;在治疗试验组中,8G10D7对禽来源的病毒感染具有较高的保护率,可达100%,对人来源的H5N1型禽流感病毒最高也可达87.5%的保护率.该抗体的获得不仅为H5N1型高致病性禽流感病毒的预防和治疗带来了希望,同时其中和位点的发现也为以后亚单位疫苗的研制提供新的思路.
- 张晓曾晓燕刘哲金秋徐言冯振卿焦永军
- 关键词：H5N1型禽流感病毒单克隆抗体血凝抑制
- H5N1高致病性禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达被引量：1
- 2011年
- 目的:扩增高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因,并进行真核表达。方法:抽提毒株A/Jiangsu/08-6基因组RNA,反转录为cDNA,用特异性引物扩增HA基因。HA经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆到pFastBac-GP67B载体上,筛选出阳性重组转座质粒pFastBac-GP67B-HA,并将其进一步转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定后,获得重组穿梭载体(rBacmid-HA),再通过CellfectinⅡ试剂转染rBacmid-HA至对数生长期的sf9昆虫细胞,进行目的蛋白的真核表达。分别用SDS-PAGE、Western blot、血凝试验以及质谱分析对其进行鉴定。结果:HA基因在sf9细胞表达的蛋白分子量约70 000。血凝试验表明重组HA蛋白可使鸡红细胞发生凝集。质谱分析鉴定该重组蛋白为HA蛋白。结论:重组HA蛋白具有天然HA蛋白的活性,为亚单位疫苗的研制及中和抗体的筛选奠定了基础。
- 金秋刘哲陆敏华戴望舒徐言张晓曾晓燕冯振卿焦永军
- 关键词：H5N1型禽流感病毒血凝素血凝试验
