蒋进
- 作品数：6 被引量：7H指数：2
- 供职机构：南京农业大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：中农-南农青年教师开放基金转基因生物新品种培育专项国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 通用型动物转基因载体的构建及验证被引量：2
- 2012年
- 为了构建通用型动物转基因载体,以pBluescriptⅡKS+为基础,根据标记基因所含酶切位点,设计改造多克隆位点,插入从pTARGET载体中扩增的SV40启动子及新霉素磷酸转移酶基因(Neo),其下游插入共表达序列、增强型绿色荧光蛋白质基因(EGFP)及SV40 poly A,并在SV40启动子上游和SV40 poly A下游各添加一个同向的LoxP位点,构建成通用载体pNIGFP,标记基因上游拥有Xho I、Sal I、SacⅡ多克隆位点,下游拥有Nhe I、Cla I、Sac I位点。酶切鉴定和测序表明pNIGFP构建正确。pNIGFP脂质体法转染山羊胎儿成纤维细胞,荧光显微镜下观察到EGFP高表达。遗传霉素(G418)筛选表明,Neo基因表达正常,山羊胎儿成纤维细胞的最适筛选浓度为600"g/ml。pNIGFP可利用G418进行抗性筛选,还可通过EGFP表达对外源基因的整合进行实时跟踪,另外,该载体具有LoxP位点,外源基因整合后可用Cre重组酶去除标记基因,具有高效、方便、安全的特点。
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- 关键词：LOXP
- 豚鼠发情周期不同时期的子宫LHR mRNA差异表达研究被引量：1
- 2011年
- 【目的】克隆豚鼠子宫黄体生成素受体(LHR)基因片段并分析其进化关系,研究豚鼠子宫LHR mRNA在发情周期不同时期的表达特性。【方法】以豚鼠子宫总RNA为模板,根据小鼠、大鼠、猪LHR保守区设计引物,RT-PCR扩增LHR基因片段。筛选阳性克隆测序,采用DNAMAN软件分析比对同源性。以β-actin为分子内参,采用优化的半定量RT-PCR技术,测定豚鼠发情周期不同时期的子宫组织LHR mRNA表达量。【结果】测序得到686 bp的剪接变异体1和缺失75 bp 4号外显子的剪接变异体2。686 bp序列与人类LHR mRNA序列同源性为83.8%,与牛、猪及绵羊LHR mRNA序列同源性分别为84.6%、84.2%及83.6%,而与大鼠和小鼠LHR mRNA序列同源性则分别高达93.7%和99.4%。LHR mRNA在豚鼠整个发情周期的子宫中都有表达,发情周期第0天的表达水平为0.635±0.0194,第4天为0.617±0.099,均显著低于第8天的表达水平(P<0.05),随之在第12天升至1.218±0.049。【结论】克隆的片段为豚鼠LHR基因的部分序列,其mRNA存在着剪接变异体。豚鼠子宫LHR mRNA在发情周期第0、4天表达水平较低,第12天升至最高,即发情周期不同时期的LHR mRNA表达呈现明显的规律性,该结果为探究哺乳动物非性腺组织中LHR的功能及生殖内分泌调控机制提供了理论依据。
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- 关键词：发情周期子宫半定量RT-PCR
- DNA疫苗的运送载体——减毒霍乱沙门氏菌被引量：2
- 2011年
- 霍乱沙门氏菌是人兽共患病原菌,遗传背景清楚,利用它作为载体表达外源抗原基因已得到较广泛的研究并取得了一定的效果。本文从沙门氏菌的侵入途径、减毒重组菌对基因疫苗的呈递及诱发免疫应答的机制、作为载体的优势以及免疫存在的问题等方面就减毒霍乱沙门氏菌作为运送DNA疫苗的载体作简要概述。
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- 关键词：减毒沙门氏菌基因免疫
- 豚鼠抑制素基因免疫及子宫LHR mRNA表达的研究
- 豚鼠是不同于大鼠,小鼠的实验动物,它具有相对较长的发情周期(16～19d)、较长的妊娠期(68 d左右)和较少的排卵数(平均3.8个),是研究动物繁殖性状理想而珍贵的模型。本文应用基因克隆、免疫中和、RT-PCR等技术研...
- 蒋进
- 关键词：基因免疫发情周期实验动物繁殖性状子宫组织
- 基于GFP的锌指核酸酶真核细胞筛选体系的构建与验证
- 2014年
- 旨在构建基于GFP报告基因的ZFN真核细胞筛选体系,为ZFN的筛选提供一种直观、准确、灵敏的方法。以pEGFP-N1为基础,去除EGFP基因的起始密码子后在多克隆位点上游插入ATG,构建筛选体系的通用载体pEGFP-ATG。将ZFN的靶序列插入到通用载体EGFP基因上游,且使起始密码子和EGFP基因处于不同ORF中,构建筛选载体pEGFP-728。将pEGFP-728转入Hela细胞中,G418筛选Hela-728细胞系,转染ZFN到Hela-728,48h内通过观察荧光判断ZFN是否有效,挑取荧光细胞进行PCR、测序验证靶序列的敲除。测序分析表明,通用载体pEGFP-ATG和含靶序列的筛选载体pEGFP-728序列完全正确;pEGFP-728转入Hela细胞中观察不到绿色荧光,说明靶序列插入后使EGFP发生移框;转染靶序列对应的ZFN到Hela-728中,48h观察到荧光的表达,说明ZFN有效;挑取6个荧光细胞单克隆,PCR、测序表明4个克隆靶序列发生缺失突变。锌指核酸酶真核细胞筛选体系构建成功。相对于其他方法本筛选体系更加准确、直观、灵敏,更适用于动植物等真核细胞的ZFN筛选,同时还可应用于TALEN和CAS9的筛选。
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- 关键词：锌指核酸酶绿色荧光蛋白真核细胞
- 磷酸二酯酶6与视网膜病变被引量：2
- 2010年
- 磷酸二酯酶6(PDE6)是对环鸟苷酸(cGMP)特异的PDE,广泛分布于视网膜杆状光感受器细胞中,是脊椎动物光转录过程中的关键酶。它通过调节细胞内特定区域的cGMP水平,参与脊椎动物视觉传导级联反应。PDE蛋白质亚基的结构域通过与转导蛋白的直接作用来调节PDE的活性,从而调节光子的转导过程。视网膜色素变性(RP)等疾病的发生与PDE蛋白质亚基的突变密切相关。近年来PDE同工酶在细胞中的定位及定量研究为选择性调节药物的开发提供了研究基础。就PDE6的结构、功能、视功能调控机制及应用前景进行综述。
- 蒋进惠锋明茆达干
- 关键词：环鸟苷酸
