肖东
- 作品数：63 被引量：104H指数：5
- 供职机构：南方医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省科技计划工业攻关项目广东省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学文化科学更多>>
- 去甲基化酶ALKBH5高、低表达食管鳞癌细胞株的构建被引量：1
- 2019年
- 目的构建高、低表达去甲基化酶ALKBH5的食管鳞癌(ESCC)细胞株。方法将生长状态良好的人源胚胎肾细胞293T于培养瓶内培养,分别记为A、B、a、b、c组,待细胞融合80%～90%后进行质粒转染,A组293T细胞转染高表达ALKBH5的质粒p LV-ALKBH5,B组293T细胞转染对照质粒p LV-con,上述2个质粒中均带有GFP蛋白和Flag标签蛋白(用于后续感染细胞的筛选); a组293T细胞转染低表达ALKBH5的质粒p LKO-shALKBH5-1,b组293T细胞转染低表达ALKBH5的质粒p LKO-shALKBH5-2,c组293T细胞转染对照质粒p LKO-shSCR,上述3个质粒中均带有嘌呤霉素抗性(用于后续感染细胞的筛选)。上述各组293T细胞质粒转染72 h后,分别收集细胞上清液,离心后分装;用A、B组细胞上清液分别感染ESCC细胞株(Eca109细胞和Kyse510细胞),采用流式细胞术筛选GFP蛋白(+)的细胞待测;用a、b、c组细胞上清液分别感染ESCC细胞株(Eca109细胞和TE-13细胞),用嘌呤霉素筛选细胞待测。采用qRT-PCR法和Western blotting法分别检测感染高、低表达ALKBH5上清液的ESCC细胞中ALKBH5 mRNA和蛋白。结果感染A组细胞上清液的Eca109细胞、Kyse510细胞中ALKBH5 mRNA和蛋白的相对表达量均显著高于感染B组细胞上清液的Eca109细胞、Kyse510细胞(P均<0. 05),感染a、b组细胞上清液的Eca109细胞、TE-13细胞中ALKBH5 mRNA和蛋白的相对表达量均显著低于感染c组细胞上清液的Eca109细胞、TE-13细胞(P均<0. 05)。结论成功构建高、低表达ALKBH5的ESCC细胞株,为进一步探讨ALKBH5在ESCC发生发展中的作用提供了细胞模型。
- 方婷晓翟坚学林桃燕别亚男肖东蔡开灿
- 稳定过表达miR-26a肝癌细胞株的建立被引量：3
- 2013年
- 目的建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞株。方法以CTE049质粒为模板,PCR扩增miR-26a序列418bp,片段两侧添加XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点,In-Fusion克隆至pHAGE-fullEF1a-MCS-IZsGreen中,次日挑选单菌落,提取质粒并进行测序和酶切鉴定;所构建的载体命名为pLVT-miR26a。获得pLVT-miR26a后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR-26a和ZsGreen基因的慢病毒感染小鼠肝癌细胞(Hep1-6)、人肝癌细胞(BEL-7402、HepG2、Sk-Hep-1、HepG2-luc),以建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞系;qRT-PCR检测所建立肝癌细胞系中miR26a的表达水平。结果测序和酶切证实成功构建了pLVT-miR26a,按标准程序生产的携带miR-26a和ZsGreen基因的慢病毒上清成功感染小鼠及人肝癌细胞。结论成功建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞株,为相关后续研究打下了良好基础。
- 赵文淘赵尊兰史俊文王胜纯林晓琳李静姚开泰肖东
- 关键词：慢病毒载体肝癌
- 过表达西藏小型猪GHR显负性突变体的慢病毒载体构建及其功能验证被引量：1
- 2016年
- 目的:构建过表达西藏小型猪GHR基因显负性突变体的慢病毒载体,并对其进行功能验证。方法:首先以pRLG3A为模板,PCR扩增CAG启动子,In-Fusion克隆至Cla I/BamH I双酶切的pCD550A-1载体中,替换其EF1α启动子,获得pCAGGP;然后从西藏小型猪肝脏组织cDNA中PCR扩增GHR基因的显负性突变体片段(dnGHR);最后将dnGHR片段插入pCAGGP多克隆位点,最终得到过表达猪GHR显负性突变体的慢病毒载体pCdnGGP。对所构建的质粒进行测序和酶切鉴定。将所构建的pCdnGGP载体转染293T细胞,并将包装好的慢病毒感染猪的胚胎成纤维细胞(PEFs),倒置荧光显微镜检测GFP表达,收集细胞并提取总RNA检测dnGHR基因在293T细胞和PEFs中的表达,以对pCdnGGP进行体外功能验证。结果:测序和酶切证实成功构建了pCdnGGP。pCdnGGP转染293T细胞以及病毒感染PEFs之后,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,RT-PCR检测证实dnGHR在293T细胞和PEFs中均能正常表达。结论:成功构建过表达猪GHR基因显负性突变体的慢病毒载体,为相关后续研究打下了良好基础。
- 贾俊双林晓琳肖东刘薇
- 关键词：西藏小型猪GHREGFP慢病毒载体
- 基于四环素调控系统构建白蛋白启动子调控大鼠uPA转基因表达的慢病毒载体
- 2019年
- 基于四环素调控系统构建白蛋白(albumin,Alb)启动子调控大鼠uPA(urokinase-type plasminogen activator,ruPA)转基因肝特异性过表达的慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-ruPA-T2A-CopGFP(pLATTRUTG)。以CTG0875-2-11质粒为模板,PCR扩增大鼠的uPA(ruPA)基因,3’端添加Flag标签,In-Fusion克隆至pLVX-Alb-TetOne-TRE-T2A-CopGFP(pLATTTG)质粒中,得到慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-ruPA-T2A-CopGFP(pLATTRUTG),所构建质粒经测序和酶切鉴定。将pLATTRUTG瞬时转染293T细胞,转染后24 h倒置荧光显微镜检测CopGFP表达;接着向6孔细胞培养板内加入强力霉素(Doxycycline,Dox),48 h后在倒置荧光显微镜下观察CopGFP表达(包括未加Dox的孔),随后收集细胞以提取总RNA和总蛋白,用于RT-qPCR检测ruPA及报告基因表达和Western blot检测标签蛋白Flag表达。酶切和测序确证我们成功构建了慢病毒载体pLATTRUTG;瞬转293T细胞后,24 h倒置荧光显微镜下可见零星细胞(约占0.1%)发弱的绿色荧光,加Dox 48 h后所有细胞展现强的绿色荧光,而不加Dox的孔内仍然只见到零星细胞(约占0.1%)发弱的绿色荧光。RT-qPCR和Western blot检测结果显示,与不加Dox的细胞相比,加Dox的细胞中ruPA、报告基因CopGFP和Flag表达水平显著升高。结果提示,成功基于四环素调控系统构建Alb启动子调控大鼠uPA转基因表达的慢病毒载体pLATTRUTG,为相关后续实验奠定了基础。
- 张晟黎海燕廉梅刘宇肖东林晓琳
- 关键词：慢病毒载体
- 利用高压水枪法将双报告基因导入小鼠肝脏
- 2016年
- 目的:通过高压水枪法将双报告基因[即绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Luc)]导入小鼠肝脏,以熟练掌握高压水枪法,其将为后续相关研究奠定方法学基础。方法:将质粒pcEF.luc-IRES-GFP瞬时转染入人肝癌细胞SMMC-7721以进行载体体外功能验证,并利用高压水枪法将质粒pcEF.luc-IRES-GFP经尾静脉注射入小鼠肝脏内,经小动物活体成像系统活体检测GFP和Luc信号,同时免疫组化检测GFP在肝组织中的表达情况。结果:瞬转结果显示,7721细胞上可检测到GFP和Luc表达;利用高压水枪法将pcEF.luc-IRES-GFP导入小鼠肝脏后,利用小动物活体成像仪成功在肝内检测到GFP和Luc信号;免疫组化结果显示部分肝细胞表达GFP。结论:成功掌握了将目的基因导入小鼠肝脏的高压水枪法,这为相关后续研究打下良好基础。
- 贾俊双林霞罗冰敏陈丽刘宇肖东林晓琳
- 关键词：尾静脉肝脏
- 慢病毒介导的外源基因体外投递系统的建立被引量：19
- 2008年
- 目的针对不同哺乳类细胞建立相应的慢病毒体外感染体系,以建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统。方法按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒(携带EGFP基因)包装(脂质体介导的瞬时转染)、超速离心浓缩和保存等,随后用病毒上清或浓缩后的病毒感染293FT细胞,24～48h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功生产;将携带EGFP基因的病毒上清或浓缩后的病毒分别加入内含293FT细胞、小鼠ES细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)或小鼠睾丸生殖细胞的培养板孔内,感染6～12h后,用相应培养基替换感染液,数天后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功感染不同哺乳类细胞。结果按标准程序生产的携带EGFP基因慢病毒(病毒上清或浓缩后的病毒)成功高效率感染293FT细胞、MEFs或小鼠睾丸生殖细胞;用浓缩后的病毒(携带EGFP基因)感染小鼠ES细胞,亦可获得EGFP阳性的ES细胞克隆。结论熟练掌握了慢病毒包装、浓缩及鉴定等技术,同时针对不同哺乳类细胞建立了相应的慢病毒介导的外源基因体外传递系统,这些为相关后续研究打下了良好的基础。
- 贾俊双孙妍肖东姚开泰
- 关键词：慢病毒小鼠胚胎干细胞小鼠胚胎成纤维细胞
- 我国公务员基本权利的保障
- 公务员是国家权力的具体执行者,国家机器的正常运行离不开公务员的努力工作。公务员的基本权利是公务员享有的一项最基础、最重要的权利。保障公务员的基本权利,能促使公务员更好地行使职权、更好地为人民服务,能很好地反作用于我国的法...
- 肖东
- 关键词：公务员基本权利法律保障行政管理法司法救济
- 文献传递
- 构建Eμ-VH启动子调控c-Myc表达的慢病毒载体及其功能验证
- 目的 构建人B淋巴细胞特异性启动子Eμ-VH调控c-Myc表达的慢病毒载体pEMIR.方法 首先以pLV-c-Myc-IRES-EGFP为模板,PCR扩增目的基因c-Myc,In-Fusion克隆至EcoR V/Sal ...
- 陈琳陈燕肖东
- 关键词：C-MYCEGFP慢病毒载体
- PLAC1特异性TCR基因修饰T细胞对乳腺癌的抗肿瘤作用被引量：2
- 2018年
- 目的研究胎盘特异性基因1(PLAC1)特异性T细胞受体(TCR)基因修饰T细胞对乳腺癌的抗肿瘤作用。方法磁珠分选人类白细胞抗原分型为A2(HLA-A2)的志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中的CD8^+T细胞,流式检测CD8^+T细胞的表型。通过慢病毒载体构建、包装,将可识别乳腺癌肿瘤抗原PLAC1的HLA-A2限制性的TCR基因导入CD8^+T细胞(称为TCR-T细胞),以慢病毒空载体包装、感染的CD8^+T细胞(NC-T细胞)作为对照细胞,通过流式细胞术检测PLAC1特异性TCR的表达效率。免疫荧光和流式细胞术检测乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231(三阴性乳腺癌细胞)的PLAC1和HLA-A2血清型的表达。WST-1法检测不同效靶比(5:1、10:1和20:1)TCR-T细胞或NC-T细胞与乳腺癌细胞MCF-7或MDA-MB-231作用后的细胞毒性,并通过ELISA检测共培养后T细胞IFN-γ的释放量。通过裸鼠皮下人乳腺癌移植瘤模型检测TCR-T细胞以及NC-T细胞的抗肿瘤作用。采用单因素方差分析及独立t检验进行统计学分析。结果磁珠分选出的CD8^+T细胞CD3^+CD8^+比例达到(98.89±0.30)﹪。经慢病毒感染、五聚体检测,TCR-T细胞中PLAC1特异性TCR的正确表达率为(24.58±0.82)﹪,NC-T细胞不表达PLAC1特异性TCR。免疫荧光和流式结果显示乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231为HLA-A2和PLAC1双阳性表达细胞。其中流式检测结果显示,MCF-7和MDA-MB-231细胞中HLA-A2的表达效率分别为(93.04±1.36)﹪和(98.72±0.12)﹪。在效靶比为20:1时,TCR-T细胞对MCF-7杀伤率为(51.5±1.37)﹪,高于NC-T细胞对MCF-7的杀伤率(5.93±2.40)﹪,t=15.507,P<0.01;TCR-T细胞对MDAMB-231杀伤率为(44.34±2.20)﹪,高于NC-T细胞对MDA-MB-231杀伤率(5.15±2.40)﹪(t=10.694,P<0.01)。在相同效靶比情况下,TCR-T细胞对MCF-7或MDA-MB-231细胞的细胞毒性高于NC-T细胞,且随着效靶比的增加杀伤效果增强。在效靶比为20:1时,与MCF-7共培养后TCR-T细胞IFN-γ的分泌水平[(347.49±4.10)pg/ml]高于NC-T细胞[(18.14±6.22)pg/m
- 李琼书成先义胡源陈洁莹巩秀肖东胡祥刘未斌
- 关键词：乳腺癌TCRCD8^+T细胞肿瘤免疫治疗
- 基于Tet-On系统构建Alb启动子调控猪uPA转基因表达的慢病毒载体被引量：2
- 2019年
- 目的应用Tet-On基因表达调控系统构建Alb启动子调控小型猪uPA (pig urokinase-type plasminogen activator,puPA)基因表达的慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-puPA-T2A-CopGFP(pLATTPUTG)。方法首先将pAlb-Cre-GH/BS作为模板,PCR扩增目的基因Alb-enhancer/promoter,In-Fusion克隆至Xho I/Xba I双酶切的pLVX-TetOne中,获得Alb启动子替换pLVX-TetOne原有的PGK启动子的质粒pLVX-Alb-TetOne;接着以pCD823 A-1为模板,PCR扩增T2A-CopGFP,In-Fusion克隆至BamH I/Age I酶切的pLVX-Alb-TetOne中,获得pLVX-Alb-TetOne-TRE-T2A-CopGFP(pLATTTG);最后以H8803为模板,PCR扩增puPA(3′端含Flag标签),In-Fusion克隆至pLATTTG中,最终获得慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-puPA-T2A-CopGFP (pLATTPUTG);所构建的质粒均经酶切和测序鉴定。pLATTPUTG瞬转293T细胞,转染24 h后倒置荧光显微镜检测绿色荧光;随后六孔板内加入强力霉素(Dox),48 h后倒置荧光显微镜下检测CopGFP表达(包括未加Dox的孔),接着收集细胞以抽提总RNA和总蛋白,以用于qRT-PCR检测puPA和CopGFP表达及Western blot检测Flag表达。结果酶切鉴定和测序证实成功构建了慢病毒载体pLATTPUTG。pLATTPUTG转染293T细胞,24 h后倒置荧光显微镜下未见绿色荧光,而加入Dox 48 h后几乎所有细胞均发强的绿色荧光,而不加Dox的孔内仍然未见绿色荧光;加Dox的孔内细胞上puPA、CopGFP和Flag表达水平均显著升高,而不加Dox的孔内细胞上检测到上述基因极低表达;以上数据提示,应用该Tet-On基因表达调控系统实现了puPA基因在293T细胞上可诱导性表达。结论成功基于Tet-On基因表达调控系统构建Alb启动子调控puPA转基因表达的慢病毒载体pLATTPUTG,这为相关后续研究奠定了坚实基础。
- 刘宇陈恒伟温悦婷贾俊双林晓琳肖东
- 关键词：慢病毒载体
