李朴
- 作品数：31 被引量：107H指数：5
- 供职机构：重庆医科大学附属第二医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市自然科学基金重庆市教委科研基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学电子电信文化科学更多>>
- 新型二聚体突变荧光引物定量PCR方法的建立及其在检测HCV中的应用被引量：3
- 2011年
- 目的开发新型二聚体突变荧光引物技术，建立一种能广泛应用于临床检测HCV的实时PCR方法。方法构建重组质粒pMD18-T—HCV5’NCR作为标准品，设计二聚体突变荧光引物，优化定量PCR体系，并进行方法学评价。将本法应用于临床确诊的30份HCV阳性患者、30份其他病毒性肝炎患者和30份健康志愿者血清标本的检测，定量结果与商品化TaqManHCV定量试剂盒的定量结果进行比较。结果建立了利用二聚体突变荧光引物的实时PCR方法，检测的线性范围为20-10^9IU／ml；批内CV在1．37％-4．59％之间，批间CV在1．58％-4．81％之间；对所有其他病毒性肝炎患者和健康志愿者血清HCV的检测结果均阴性，检测特异性为100％（60／60）；对临床确诊的HCV感染患者血清标本全部检出HCV阳性，定量结果与商品化TaqManHCV定量试剂盒的定量结果具有很好的相关性，相关系数R2=0．9501。结论建立的以二聚体突变荧光引物为平台的HCV实时PCR检测方法，具有快速、价廉、准确、结果可靠等特点，可为HCV感染的诊断、治疗监测和流行病学调查提供较好的技术支持。
- 夏乾峰文阳安刘靳波李朴涂植光
- 关键词：肝炎病毒属聚合酶链反应RNA病毒
- 特异性靶向巨噬细胞表达PR39的重组腺病毒抗胞内菌感染能力检测被引量：1
- 2010年
- 目的检测巨噬细胞靶向表达PR39的重组腺病毒Ad-SP/PR39在抗胞内菌方面的作用。方法重组腺病毒Ad-SP/PR39经CsCl密度梯度离心纯化,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白GPF的表达并检测重组腺病毒的滴度。Ad-SP/PR39感染小鼠巨噬细胞RAW264.7、人结肠癌细胞株Lovo、人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株ZR-75-30和非洲绿猴肾细胞株COS-7后,经RT-PCR和免疫细胞化学检测PR39的靶向表达特异性。将含Ad-SP/PR39的RAW264.7细胞裂解液作用于减毒结核分枝杆菌(BCG),检测其体外杀灭结核杆菌BCG的能力。另取RAW264.7细胞,吞噬BCG后,加入Ad-SP/PR39感染该细胞并检测细胞内活菌量,以观察其细胞内杀菌作用。结果经纯化后的重组腺病毒滴度可达5×1011efu/ml,能够有效感染小鼠巨噬细胞RAW264.7等多种细胞株。RT-PCR及免疫细胞化学技术检测各株细胞转录水平表达情况显示小鼠巨噬细胞RAW264.7能高效表达抗菌肽PR39,而其他细胞株几乎没有表达。与感染对照腺病毒Ad-C的RAW264.7细胞相比,转染Ad-SP/PR39的细胞显示出了更强的抗菌活性[BCG活菌数分别为(8.5±1.4)×106、(6.9±1.8)×106cfu/ml,P<0.05)],且能有效吞噬并杀灭胞内菌。结论本课题组构建的重组腺病毒能够靶向巨噬细胞表达抗菌肽PR39基因,发挥抗胞内菌作用,为抗菌肽在胞内菌感染治疗中的应用开辟了新思路。
- 余雪梅文阳安李朴孔飞飞陈光辉邱欣欣涂植光
- 关键词：腺病毒科巨噬细胞
- Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及Lipofectamine^(TM) 2000对4种细胞转染效率的比较被引量：2
- 2012年
- 目的将腺病毒Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000对4种细胞的转染效率进行比较,以获得Ad5F35-GFP适用的细胞种类及各类细胞适用的转染方法。方法采用携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000,分别转染人慢性粒细胞白血病细胞K562、人外周血单个核细胞(PBMC)、小鼠脂肪细胞3T3-L1和肝癌细胞Hep A1-6,于转染48 h后,倒置荧光显微镜下观察转染效率,RT-PCR法检测GFP基因mRNA的转录水平。结果 Ad5F35-GFP转染K562细胞、PBMC效率均较高,分别为61%和56%,但不能有效地转染3T3-L1(5%)、HepA1-6(15%)细胞;Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000均不能有效地转染3T3-L1细胞,转染效率分别为5%、5%和6%;Ad5-GFP、LipofectamineTM2000转染Hep A1-6细胞效率均较高,分别为73%和71%。结论 Ad5F35-GFP可有效转染人造血细胞和单核细胞,为相关基因的研究及治疗领域的应用奠定了基础。
- 成凤王秦匡文斌李朴董晋豫梁勤东涂植光
- 关键词：腺病毒转染效率
- 人YB-1的高效原核表达及其标准蛋白与抗血清的制备被引量：1
- 2011年
- 目的:构建YB1-GST表达系统,建立经济高效YB-1蛋白制备方法并制备其多抗。方法:将YB-1编码序列亚克隆至表达载体pGEX-6P-1;转化表达菌并确定可溶性表达最佳条件;采用GST亲和层析与层析柱上PSP酶切融合蛋白获取无标签蛋白的YB-1,经超滤浓缩及Western blot鉴定后,进一步真空冷冻干燥,制备YB-1标准蛋白;采用大剂量YB-1长程免疫方案免疫家兔以制备其抗体。结果:成功构建了表达载体pGEX-YB1;SDS-PAGE结果显示,YB1-GST融合蛋白以可溶性表达为主;Western blot结果证实,表达产物经GST亲和层析、PSP酶切以及真空冷冻干燥后获得了纯度较高的YB-1标准蛋白,将该蛋白免疫家兔获得了较高效价与特异性的抗体。结论:建立了YB-1-GST表达系统与经济高效的YB-1蛋白纯化方法;获得了质量较高的YB-1多抗,为进一步制备YB-1单抗、深入探讨其在肿瘤细胞中的生物学功能以及YB-1定量检测方法的建立奠定了基础。
- 李朴史静郭变琴钟梁梁勤东涂植光
- 关键词：YB-1
- 磷酸化Y盒结合蛋白1的抗体制备及其辅助诊断原发性肝癌合并肺转移的临床价值被引量：3
- 2015年
- 目的制备Y盒结合蛋白1磷酸化抗体（pAb／YB-1S102）;探讨腹水中磷酸化YB-1（pYB-1）作为标志物辅助诊断原发性肝癌合并肺转移的临床价值。方法通过生物信息学预测并化学合成102位丝氨酸磷酸化YB-1多肽，耦联载体蛋白后免疫家兔；protein A亲和层析法纯化抗血清pAb／YB-1S102，并验证其特异性。收集109例患者腹水并富集腹水中pYB-1，其中原发性肝细胞癌（HCC）36例，HCC合并肺转移44例，肝硬化29例l采用Westemblot定性检测腹水中pYB-1，并对定性结果进行回归判别与受试者工作特征（ROC）曲线分析。计数资料采用x2检验。结果酶联免疫吸附法与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示制备的pAb／YB-1渤观效价≥1：1×106，且纯度较高。Westernblot结果证实pAb／YB-1S102能特异性识别内源性pYB-1S102。肝硬化患者腹水中未检出pYB-1S102,HCC合并肺转移患者腹水pYB-1勖02阳性率（77．3％）显著高于HCC（30．6%，X2=11．69，P〈0．01）；回归分析与ROC曲线结果表明pYB-1乳衄辅助诊断HCC合并肺转移的灵敏度为77．3％，符合率为73．8％（X2=17．56，P〈0．01）。结论成功制备可识别内源性pYB-1的抗体pAb／YB-1S102通过定性检测腹水pYB-1，可鉴别诊断HCC合并肺转移。
- 聂红史静王玎麦力赵清胡琴陈维贤李朴
- 关键词：腹水
- Y盒结合蛋白1单克隆抗体的研制、表位测定及其免疫学应用被引量：5
- 2012年
- 建立稳定分泌抗人Y盒结合蛋白1单克隆抗体(anti-YB-1 mAb)的杂交瘤细胞株,鉴定其表位与免疫学应用。将重组YB-1蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。经ELISA法筛选鉴定、定株后采用腹水诱生法制备anti-YB-1 mAb;Protein G亲和层析法纯化mAb,ELISA法测定mAb效价、亚型及相对亲和力。采用抗原表位预测法鉴定anti-YB-1 mAb识别表位所在区域。Western blot和免疫组化鉴定mAb识别内源性YB-1的特异性。经筛选鉴定获得2株稳定分泌anti-YB-1 mAb的杂交瘤细胞(1-D9,3-E8);腹水抗体效价均≥1×10-6,亚型均为IgGl;1-D9和3-E8单抗识别表位分别位于(134-160aa)与(266-303aa)肽段。Western blot、免疫组化结果证实anti-YB-1 mAb能特异性识别内源性YB-1。该研究为YB-1免疫学定性、定量检测方法的建立、肿瘤靶向抗体治疗及进一步探讨YB-1的生物学功能奠定了基础。
- 李朴史静成凤梁勤东匡文斌王秦董晋豫涂植光
- 关键词：YB-1单克隆抗体抗原表位免疫学检测
- CSF-DKK1作为标志物在神经母细胞瘤诊断与治疗监测中的临床价值被引量：2
- 2013年
- 目的定量检测神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)患者脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)中Dickkopf相关蛋白1(DKK1),探讨其作为诊断NB及疗效评估标志物的临床价值。方法实验组48例:NB患者经CT、骨髓检查确诊,年龄5个月至11岁,包括男性25例,女性23例;Evans分期:Ⅰ期5例,Ⅱ期20例,Ⅲ期15例,Ⅳ期8例。对照组50例:神经系统良性肿瘤25例,年龄5个月至65岁,包括男性13例,女性12例;化脓性脑膜炎10例,年龄5个月至6岁,包括男性4例,女性6例;脑外伤15例,年龄2～45岁,包括男性10例,女性5例。NB患者分别于治疗前、化疗结束后3 d及化疗联合手术治疗后3 d采集CSF样本各1次。ELISA法定量检测CSF中DKK1水平并做ROC曲线分析,对NB患者治疗后(化疗及化疗联合手术治疗)的CSF-DKK1水平进行随访检测。结果与对照组[(57.0±13.7)pg/mL]相比,NB患者CSF-DKK1水平显著增高[(88.7±22.9)pg/mL,P<0.01];ROC曲线分析表明,CSF-DKK1诊断NB(Cut-off=65.0 pg/mL)的灵敏度为83%,特异性为76%。与治疗前相比,化疗缓解组[n=35,(48.5±9.7)pg/mL]及化疗联合手术组[n=15,(46.4±7.8)pg/mL]的CSF-DKK1水平均显著下降(P<0.01),而化疗无效组的CSF-DKK1水平无明显变化[n=13,(89.1±25.7)pg/mL,P>0.05]。结论 NB患者脑脊液中DKK1水平显著升高且与疗效密切相关,可作为NB筛查诊断及疗效评估的标志物。
- 娄茜陈维贤史静李月王玎张鹏辉李朴
- 关键词：DKK1神经母细胞瘤脑脊液
- 尿GSDMD用于早期鉴别诊断泌尿系统肿瘤的用途
- 本发明属于生物标志物技术领域，具体公开了尿液GSDMD作为生物标志物在泌尿系统相关肿瘤早期鉴别诊断的用途。本发明首次发现在膀胱癌、肾癌、前列腺癌患者的尿液中，尿GSDMD水平显著增高，是早期鉴别诊断泌尿系统肿瘤的可靠生物...
- 李朴史静
- 野生型肺炎链球菌溶血素通过PI3K-I/Akt/mTOR途径诱导A549细胞自噬
- 2020年
- 目的:研究肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Sp)诱导人肺上皮细胞自噬发生的现象及其机制。方法:常规培养人肺上皮A549细胞与野生型Sp;将GFP-LC3真核载体转染A549细胞,分为实验组(Sp,MOI=30∶1)、阴性对照组[渥曼青霉素(wortmannin,WT),2μmol/L 2 h,自噬抑制剂]、阳性对照组[雷帕霉素(rapamycin,Rapa),1 mmol/L 10 h,mTOR抑制剂]和参照组(WT和Sp共同处理),各组处理时间均为1、2、3和4 h;荧光显微镜观察各组自噬点形成,透射电镜观察各组细胞自噬体结构,Western blot检测各组微管相关蛋白轻链-Ⅰ/Ⅱ(microtuble-associated protein light chain 3-Ⅰ/Ⅱ,LC3-Ⅰ/Ⅱ)、磷酸化UNC-51-K激酶1(phosphorylated UNC-51-like kinase1,P-ULK1)和螯体1(sequestosome 1,P62)的表达;将溶血素表达载体RFP-PLY(red fluorescent protein-pneumolysin)、GFP-LC3或(和)RFP-PLY转染/共转染A549细胞,Western blot检测各组磷酸肌醇3-激酶-Ⅰ/Ⅲ(phosphoinositide 3-kinase-Ⅰ/Ⅲ,PI3K-Ⅰ/Ⅲ)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、Beclin-1蛋白(Beclin 1 protein,Beclin-1)和哺乳动物雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin,mTOR)的表达。结果:处理A549细胞3 h后,与阴性对照组(WT)相比,Sp感染后,自噬点明显增多(t=41.313,P=0.001),电镜观察到典型的自噬体结构,LC3-Ⅱ蛋白表达明显上调(t=121.592,P=0.000);A549细胞转染RFP-PLY处理3 h后,与阴性对照组(WT)相比,Sp感染同样观察到明显的自噬现象,PI3K-I、Akt蛋白和mTOR表达下调(tPI3K-I=16.544,PPI3K-I=0.004;tAkt=22.679,PAkt=0.002;tmTOR=19.503,PmTOR=0.003),而PI3K-Ⅲ和Beclin-1水平无明显差异(tPI3K-Ⅲ=3.572,PPI3K-Ⅲ=0.070;tBeclin-1=0.799,PBeclin-1=0.508)。结论:野生型Sp诱导A549细胞自噬可能通过PI3K-I/Akt/mTOR信号途径。
- 涂朝林李朴周小兰陈维贤
- 关键词：肺炎链球菌溶血素蛋白激酶B
- 建立非均衡竞争叶酸定量测定的化学发光免疫分析法
- 2017年
- 目的 制备抗人叶酸（FA）抗血清并应用异硫氰酸荧光素（FITC）系统开发新型非均衡竞争技术,建立可常规应用的定量检测血清 FA的化学发光免疫分析法.方法 FITC-FA类似物、FA抗体-HRP依次加入包被有抗 FITC抗体的化学发光板,形成FITC抗体-FITC-FA类似物-FA抗体-HRP的免疫反应复合物;并进行方法学评价,同时与非 FITC检测系统及罗氏化学发光免疫分析系统检测结果进行比较.结果 成功制备FA抗血清并建立基于FITC系统的非均衡竞争化学发光免疫法;经方法学评价,自研法的线性相关系数绝对值〉0.9900,灵敏度1.21 nmol/L,线性范围1.21~38.80 nmol/L,批内变异系数〈5%,自研法定量检测性能优于非FITC系统;与罗氏检测系统结果有较好相关性（R=0.9081）.结论 建立的非均衡竞争定量检测血清FA化学发光免疫分析法,具有良好的检测灵敏度与特异性,可应用于常规检测.
- 张羽锋李朴刘诗平
- 关键词：非均衡竞争叶酸化学发光免疫分析法
