张英
- 作品数：7 被引量：5H指数：1
- 供职机构：四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学更多>>
- 赖型钩端螺旋体LipL32-HlyX融合基因真核表达载体的构建及在COS7细胞中融合表达的研究
- 2009年
- 从赖型钩端螺旋体017株全基因组中通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)分别扩增出脂蛋白32(LipL32)和溶血素-X(HlyX)基因,应用重叠延伸PCR技术(Gene splicing by overlap extension PCR,SOEPCR)获得LipL32-HlyX融合基因。以pcDNA3.1为载体,LipL32-HlyX为目的基因,双酶切构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经双酶切、PCR及测序鉴定证实重组质粒构建成功。脂质体转染法将构建成功的重组质粒转染COS7细胞,RT-PCR扩增出约2000bp的目的基因,Western blotting分析发现在75KD处出现特异性的阳性条带。结果证实赖型钩端螺旋体LipL32-HlyX融合基因真核表达载体能在哺乳动物细胞中表达,为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础。
- 黄毕鲍朗钟琪张会东张英
- 关键词：钩端螺旋体真核表达
- 赖型钩端螺旋体Loa22重组质粒的蛋白表达和对巨噬细胞的毒性作用被引量：3
- 2008年
- 目的对赖型钩端螺旋体Loa22基因进行表达和功能研究。方法构建赖型钩端螺旋体Loa22成熟肽重组质粒,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目标蛋白表达情况。经亲和层析获得目标蛋白并作用于小鼠巨噬细胞ANA-1,检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力、四氮唑复合物(XTT)吸光度值和细胞凋亡率以评价其细胞毒性。结果成功构建Loa22成熟肽原核表达质粒,通过鉴定并纯化得到Loa22成熟肽,该蛋白使培养ANA-1细胞上清液中LDH活力升高,XTT吸光度值下降,细胞凋亡率增加。结论Loa22对ANA-1具有明显的毒性效性,该基因可能是致病钩体的一个重要毒力相关基因。
- 张英鲍朗朱海龙黄毕章乐张会东
- 关键词：钩端螺旋体巨噬细胞细胞毒性
- 赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究
- 2008年
- 目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS-7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础。方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1-LipL32。脂质体转染法将重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Westernblot检测目的基因的表达。结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中获得瞬时和稳定表达。结论:赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据。
- 黄毕鲍朗钟琪商正玲张会东张英
- 关键词：钩端螺旋体真核表达
- 赖型钩端螺旋体OmpA外膜基因Loa22重组卡介苗的构建及其免疫蛋白表达被引量：1
- 2010年
- 目的以赖型钩端螺旋体外膜蛋白A(OmpA)膜蛋白基因Loa22去信号肽基因片段构建重组卡介苗并对其免疫蛋白进行表达分析。方法以赖型钩端螺旋体56601株全基因组DNA为模板,PCR扩增出Loa22成熟肽基因片段,与大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭整合质粒pMV361一起分别经过双酶切,连接,转化。筛选鉴定出阳性重组质粒rpMV361-loa22,电转化入BCG,经筛选鉴定后,热诱导表达,通过SDS-PAGE及Western Blotting鉴定其表达产物。分别用BCG、rBCG-pMV361、rBCG-loa22、Loa22蛋白、灭活全钩体免疫小鼠两次后,脱臼处死小鼠分离脾淋巴细胞,XTT比色法检测体外脾淋巴细胞增殖活性。结果PCR扩增获得516 bp的片段,成功构建重组穿梭质粒rpMV361-loa22,经电转化构建重组卡介苗成功,热诱导表达出相对分子质量约19×103特异条带。体外脾淋巴细胞增殖实验证实rBCG-loa22可引起细胞反应,其增殖活性与BCG组和rBCG-pMV361组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了赖型钩端螺旋体重组卡介苗rBCG-loa22并高效表达具有免疫学活性的外膜蛋白Loa22,为新一代钩端螺旋体疫苗研究打下了基础。
- 李道坤鲍朗张英孙湛
- 关键词：赖型钩端螺旋体外膜蛋白A重组卡介苗免疫保护
- 赖型钩端螺旋体OmpA外膜蛋白Loa22通过Ca^(2+)信号通路介导A549细胞凋亡被引量：1
- 2011年
- 目的研究赖型钩端螺旋体(简称钩体)外膜蛋白Loa22通过Ca2+信号通路对细胞凋亡的影响,探讨该基因在钩体黏附侵袭细胞并诱导其凋亡过程中可能的信号传导机制。方法以人肺腺上皮细胞(A549)为模型,用100μg/mL纯化Loa22成熟肽作用于细胞24 h,检测细胞凋亡及细胞内游离钙浓度([Ca2+]i),观察F-actin细胞骨架变化,检测钙调素(CaM)mRNA表达水平。同时设磷脂酶C(PLC)特异阻断剂U73122预处理+Loa22成熟肽组,观察上述指标变化。结果 Loa22成熟肽作用A549后,细胞凋亡率升高,并诱导[Ca2+]i增加,CaMmRNA表达水平及乳酸脱氢酶(LDH)活性上升,F-actin细胞骨架重排。而预先用U73122预处理后,细胞凋亡率、[Ca2+]i、CaMmRNA和LDH活性均降低(P<0.01),F-actin细胞骨架重排程度减轻。结论 Loa22成熟肽通过PLC信号通路触发细胞[Ca2+]i升高,导致F-actin细胞骨架重排,从而引发细胞凋亡,提示该基因参与钩体侵袭细胞引发细胞凋亡病理过程,可能是致病性钩体的一个重要毒力相关基因。
- 吴秉婷鲍朗孙湛李道坤张英
- 关键词：赖型钩端螺旋体细胞凋亡钙调素
- 赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的真核表达及基因免疫
- 2008年
- 目的在哺乳动物细胞中表达含有赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的重组质粒，并检测其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果。方法以赖型钩端螺旋体全基因组为模板，PCR扩增出目的基因HlyX，以质粒pcDNA3．1为载体，双酶切构建重组质粒，转化大肠杆菌DH5α，双酶切、PCR及测序鉴定重组质粒。将构建成功的重组质粒转染COS-7细胞，通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达。将重组质粒免疫BALB／c小鼠，每两周1次，共3次，ELISA法检测小鼠的体液免疫应答水平。结果扩增出全长约1100bp的HlyX基因，重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定表明重组质粒构建成功。RT-PCR检测显示重组质粒转染组能扩增出约1100bp的目的基因片段，Western blot分析可见在相对分子质量（Mr）40×10^3左右出现特异性的目的条带。DNA免疫后诱导小鼠产生了较高的抗体水平（1：6561～1：19683）。结论赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX真核表达质粒能够诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体，为其作为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础。
- 黄毕鲍朗钟琪商正玲张会东张英
- 关键词：钩端螺旋体真核表达基因免疫
