龚小卫
- 作品数：49 被引量：340H指数：9
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- 相关领域：医药卫生生物学文化科学更多>>
- PRAK不同突变体的构建、表达及细胞内定位的研究
- 2007年
- 目的:构建p38调节/激活蛋白激酶(PRAK)不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中表达后,观察这些突变体在细胞内的定位情况。方法:将克隆在绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上的野生型PRAK通过定点突变技术构建其无活性突变体PRAK(T182A)、活性突变体PRAK(T182D)、无激酶活性突变体PRAK(KM)、核定位信号缺失突变体PRAK(NLSm)及核输出信号缺失突变体PRAK(NESm),随后转染NIH3T3细胞,并在荧光显微镜下观察其表达和细胞内定位情况。结果:经测序鉴定各种PRAK不同突变体正确无误后,在NIH3T3细胞中得到高量表达;融合蛋白发出的绿色荧光表明,在静息状态下,野生型PRAK(WT)、PRAK(182A)、PRAK(182D)、PRAK(KM)和PRAK(NESm)主要分布于细胞核内,而PRAK(NLSm)在细胞中均匀分布;在受到NaAsO2刺激后,PRAK(WT)和PRAK(KM)移位出核,而PRAK(182A)、PRAK(182D)和PRAK(NESm)失去了移位出核的能力,PRAK(NLSm)则与刺激前无明显差异。结论:成功构建了PRAK不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体并在真核细胞中进行了表达,且不同的突变体能够影响PRAK的细胞内定位。
- 龚小卫彭毅唐靖魏洁邓鹏姜勇
- 关键词：点突变基因表达细胞内定位
- 人p53不同突变体的构建、表达及其对亚砷酸盐诱导细胞凋亡的影响被引量：1
- 2008年
- 目的构建人p53的不同突变体,并在真核细胞中表达,研究这些突变体对应激刺激诱导细胞凋亡的影响。方法采用PCR方法扩增人p53 cDNA序列,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3/HA载体中,对阳性克隆进行酶切和PCR鉴定。将阳性重组体的第15位和第46位丝氨酸突变为丙氨酸,并转染NIH3T3细胞,观察其在NIH3T3细胞内的表达情况。转染不同突变体的NIH3T3细胞用Annexin V-FITC和碘化丙啶双标后,利用流式细胞术检测亚砷酸盐刺激前后的凋亡情况。结果构建的pcDNA3/HA-p53(WT)、pcDNA3/HA-p53(S15A)和pcDNA3/HA-p53(S46A)是正确的,且能在NIH3T3细胞内有效表达。流式细胞术检测表明,p53(WT)的表达使亚砷酸盐诱导的细胞凋亡增加,p53(S15A)的表达使细胞凋亡减少,而p53(S46A)没有明显影响。结论p53的第15位丝氨酸在其介导亚砷酸盐诱导的细胞凋亡中具有重要作用。
- 刘爱华龚小卫魏洁明小燕王达安邓鹏罗深秋姜勇
- 关键词：P53定点突变基因表达细胞凋亡亚砷酸盐
- p38 MAPK信号通路参与受体介导的细胞内吞的调控被引量：13
- 2007年
- 目的:观察p38MAPK信号转导通路在受体介导的细胞内吞中的作用。方法:利用Alexa594标记的转铁蛋白作为受体介导的内吞作用的观察指标,来研究p38特异性抑制剂SB203580或ERK通路特异性抑制剂PD98059预处理以及p38基因敲除对该过程的影响。结果:在受体介导的细胞内吞中,p38被磷酸化激活。SB203580的预处理或p38基因的敲除都能阻断受体介导的细胞内吞,而PD98059的预处理对该过程没有影响。结论:p38MAPK信号转导通路参与了受体介导的细胞内吞的调控。
- 龚小卫魏洁李煜生程蔚蔚邓鹏姜勇
- 关键词：P38MAPK信号转导
- Prdx4蛋白表达改变对HeLa细胞迁移和侵袭的影响被引量：3
- 2016年
- 目的:观察过氧化物还原酶4(peroxiredoxin 4,Prdx4)蛋白表达的改变对人宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭的影响。方法:采用脂质体瞬时转染法将表达质粒pc DNA3.0-HA-Prdx4转染HeLa细胞;LV-Prdx4 RNAi重组病毒感染HeLa细胞,构建Prdx4 shRNA HeLa细胞系沉默Prdx4的表达;用蛋白质印迹法证实Prdx4蛋白表达水平的变化;应用划痕愈合实验和Transwell迁移及侵袭实验分别检测细胞迁移及侵袭能力的变化。结果:pc DNA3.0-HA-Prdx4质粒转染组He La细胞的Prdx4蛋白表达水平明显上调(P<0.05),而Prdx4 shRNA HeLa稳定干扰细胞系Prdx4表达水平明显下调(P<0.05)。Prdx4过表达组HeLa细胞的迁移和侵袭能力明显增强,与空白对照组及空载体转染组比较,差异显著(P<0.01)。Prdx4表达干扰组HeLa细胞的迁移和侵袭能力明显受到抑制,与空白对照组及阴性对照组比较,差异显著(P<0.01)。结论:上调Prdx4蛋白表达水平可促进HeLa细胞的迁移和侵袭,在宫颈癌的发生和发展过程中可能起重要作用;下调Prdx4蛋白表达水平可以明显抑制HeLa细胞的迁移和侵袭能力,Prdx4有可能成为临床治疗宫颈癌的一个潜在靶点。
- 袁伟燕张丽石红琴龚小卫姜勇
- 关键词：宫颈癌细胞迁移细胞侵袭
- pNTAP-PRAK真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达
- 2010年
- 目的:构建pNTAP-PRAK真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法:将人的PRAK亚克隆至串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-PRAK,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用PolyFect脂质体介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-PRAK融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-PRAK的表达及细胞内定位情况。结果:重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-PRAK主要分布在核内。结论:成功构建pNTAP-PRAK真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对PRAK定位产生明显影响。
- 王达安龚小卫刘爱华梅柱中王丹明小燕王旭魏洁邓鹏姜勇
- 关键词：基因表达
- 人His-AWP1融合蛋白表达载体的构建及其在原核生物的表达被引量：7
- 2003年
- 目的 获取人His-AWP1融合蛋白,为下阶段深入研究AWP1的结构、功能及筛取与其相互作用的蛋白打下基础 方法 应用逆转录聚合酶链反府(RT-PCR)法从人ECV304内皮细胞系中克隆AWP1 cDNA,并将其重组于能表达6个组氨酸残基的原核表达质粒DET-14b中。经酶节、序列鉴定,选择正确重组克隆,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用Ni2+-NTA His柱纯化和SDS-PAGE分离蛋门。结果克隆到一个627 bp的AWP1 cDNA片段.重组质粒目的DNA测序正确.纯化出了一个分子量约为38 kD的融合蛋白。结论用基因工程方法在原核细胞表达并成功纯化出His-AWP融合蛋白。
- 莫永炎曹永宽刘亚伟龚小卫姜勇
- 关键词：ECV304细胞
- 丝裂原活化蛋白激酶激活蛋白激酶(MK)研究进展被引量：5
- 2007年
- 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路介导多种重要的细胞生理反应.对下游蛋白激酶的磷酸化是MAPK家族成员发挥生理作用的重要方式.在MAPK的下游存在3个结构上相关的MAPK激活蛋白激酶(MAPKAPKorMK),即MK2,MK3和MK5.在被MAPK激活后,MK可将信号传递至细胞内不同靶标,从而在转录和翻译水平调节基因表达,调控细胞骨架和细胞周期,介导细胞迁移和胚胎发育.最近,在基因敲除研究的基础上,不同MK亚族成员之间的功能区分已经逐渐明晰,使我们对于MK的认识有了长足的进步.
- 龚小卫姜勇
- 关键词：丝裂原活化蛋白激酶信号转导
- Prdx4蛋白表达水平改变对人宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响被引量：8
- 2015年
- 目的 :观察过氧化物还原酶4(peroxiredoxin 4,Prdx4)蛋白表达水平的改变对人宫颈癌He La细胞增殖和凋亡的影响。方法:采用脂质体瞬时转染法将表达质粒pc DNA3.0-HA-Prdx4(以pc DNA3.0-HA空载体为阴性对照)和针对人Prdx 4基因的3种小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)(以阴性对照si RNA为阴性对照)分别转染宫颈癌He La细胞;用蛋白质印迹法证实Prdx4蛋白表达水平被改变后,采用MTT法和FCM法分别检测He La细胞的增殖活性和凋亡情况。结果 :pc DNA3.0-HA-Prdx4质粒转染组He La细胞的Prdx4蛋白表达水平明显上调(P<0.05),而3个Prdx4 si RNA干扰组的Prdx4表达水平均明显下调(P值均<0.05)。Prdx4过表达组He La细胞的增殖能力与空白对照组及空载体转染组比较,未发生明显改变(P值均>0.05),且凋亡细胞百分率差异也无统计学意义(P值均>0.05);而3个Prdx4表达干扰组He La细胞的增殖能力较阴性对照组均明显降低(P值均<0.05),凋亡细胞百分率均明显提高(P值均<0.05)。结论 :Prdx4蛋白表达水平上调对He La细胞的增殖和凋亡没有明显影响,但其下调会抑制He La细胞增殖并促进细胞凋亡。推测Prdx4有可能成为临床治疗宫颈癌的一个潜在靶点。
- 石红琴袁伟燕张丽龚小卫姜勇
- 关键词：宫颈肿瘤细胞增殖
- pNTAP-MK2真核表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立
- 2010年
- 目的构建pNTAP-MK2真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法将MK2亚克隆至串联亲和纯化载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-MK2,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用脂质体PolyFect介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAPtag-MK2融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAPtag-MK2的表达及细胞内定位情况。结果重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAPtag-MK2主要分布在核内。结论成功构建pNTAP-MK2真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对MK2定位产生明显影响。
- 王达安龚小卫刘爱华梅柱中王丹明小燕王旭魏洁邓鹏姜勇
- 关键词：真核表达载体分子克隆基因表达
- p38 MAPK在细胞内的定位及其对LPS刺激的反应被引量：1
- 2001年
- 姜勇龚小卫张琳秦清和王静珍邓鹏郭爱华孙学刚
- 关键词：丝裂原活化蛋白激酶P38MAPK细胞定位LPS
