高锦兰
- 作品数：16 被引量：3H指数：1
- 供职机构：中国医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金辽宁省教育厅高校重点实验室项目辽宁省高校创新团队支持计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 野生型和突变型GDF5蛋白表达及亚细胞定位的研究
- 2012年
- 目的研究人生长分化因子5基因(GDF5)c.1118T>G(p.L373R)突变对GDF5蛋白在HEK-293细胞系表达及其亚细胞定位的影响。方法构建pDsRed1-N1-GDF5-WT和pDsRed1-N1-GDF5-L373R载体,分别转染HEK-293细胞,细胞培养72h后通过荧光显微镜观察比较野生型和突变型GDF5蛋白荧光分布情况。结果 GDF5蛋白在HEK-293细胞中成功表达,在荧光显微镜下观察到转染野生型和突变型GDF5的细胞胞浆均匀发出红色荧光,而空载体组的红色荧光则弥散于全细胞,荧光强度均匀一致。结论野生型和突变型GDF5蛋白均定位于HEK-293细胞质。
- 刘杏王述森刘琦高锦兰罗阳
- 关键词：生长分化因子5蛋白表达
- Cyclin G2与LDHA相互作用的鉴定分析
- 2020年
- 目的分析细胞周期素G2(cyclin G2)与乳酸脱氢酶A(LDHA)之间的相互作用及其意义。方法将LDHA全长cDNA片段分别克隆到pGEX-5X-1和p3×FLAG-CMV-14载体上,构建pGEX-LDHA原核重组蛋白表达载体和p3×FLAG-CMV-LDHA真核重组蛋白表达载体,诱导表达并纯化GST-LDHA融合蛋白,通过GST pull-down及western blot技术分析cyclin G2与LDHA的相互作用。分别转染p3×FLAG-CMV-LDHA、pEGFP-FALGCCNG2质粒到HEK293细胞使其表达,利用带有抗FLAG蛋白标签抗体的免疫沉淀凝胶进行Co-IP实验,进一步验证cyclin G2与LDHA的相互作用。结果成功构建了pGEX-LDHA原核重组蛋白表达载体和p3×FLAG-CMVLDHA真核重组蛋白表达载体。GST pull-down实验证实了cyclin G2与LDHA在细胞外的相互作用。Co-IP实验证实了cyclin G2和LDHA在细胞内的相互作用。结论 cyclin G2与LDHA在细胞内和细胞外能发生相互作用,为研究cyclin G2生物学功能奠定实验基础。
- 庄新宾侯晓宇李森高锦兰刘琦罗阳
- 关键词：免疫共沉淀相互作用
- DOC-1R基因表达载体的构建及其重组蛋白的表达纯化被引量：1
- 2009年
- 目的构建DOC-1R（deleted in oral cancer-1related）的原核表达载体并且纯化其重组蛋白，用于进-步研究DOC-1R蛋白的结构与功能。方法采用基因重组技术构建原核表达载体pGEX—DOC-1R，经DNA测序鉴定后，转化E．coliB[21，IFFG诱导表达并纯化融合蛋白。结果以菌落PCR及限制性内切酶酶切鉴定得到候选阳性克隆，测序结果表明所得到的克隆序列及开放阅读框架完全正确，IPTG诱导后SDS—PAGE电泳分析表明在40kD处出现特征蛋白表达带，经磁珠亲合层析后Western印迹检测证实得到较高纯度的GST—p14 DOC-1R融合蛋白。结论成功构建了pGEX—DOC-1R的原核表达载体，表达并纯化出GST—p14 DOC-1R融合蛋白，为DOC，1R抗体制备及研究DOC-1R蛋白结合蛋白及其在细胞周期调控中的生物学功能奠定了基础。
- 刘杏刘琦王述森高锦兰罗阳
- 关键词：DOC-1R基因表达基因克隆融合蛋白
- GDF5基因突变影响软骨细胞分化机制的研究
- 目的生长分化因子5(growth/differentiationfactor 5,GDF5)是骨形态发生蛋白家族的成员,是关节及软骨形成的重要调节因子,能够促进间充质细胞的黏附、聚集和软骨分化,维持关节内环境的稳定。GD...
- 胡煜罗阳曹丽华高锦兰李宝坤
- 关键词：生长分化因子5基因突变细胞分化
- 利用CRISPR/Cas9技术构建DOC-1R基因敲除的HEK-293稳转细胞系
- 2020年
- 目的利用CRISPR/Cas9技术敲除人胚肾(human embryonic kidney cell,HEK-293)细胞中DOC-1R,构建DOC-1R敲除的HEK-293稳转细胞系,用于进一步讨论DOC-1R的生物学功能。方法根据CRISPR/Cas9设计原则,设计向导RNA(single-guide RNA,sgRNA),构建表达载体,对sgRNA测序并转染包装HEK-293T收集上清液测定病毒滴度。前期用Cas9-puro慢病毒感染HEK-293,用已制备的DOC-1R慢病毒感染稳转Cas9的HEK-293,72 h后显微镜下观察HEK-293表达红色荧光蛋白,并用Western blot检测HEK-293中DOC-1R的表达以确定沉默效果。结果测序显示插入的sgRNA序列正确,表达载体成功构建,显微镜下观察到,90%以上HEK-293表达红色荧光蛋白,HEK-293中DOC-1R蛋白表达减少,确定了DOC-1R敲除效果最明显的序列为GCCTACCTATGCTGGCAGCA。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建DOC-1R基因敲除的细胞系,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。
- 王世全郭莹莹沈飞高锦兰邢雪莎王述森罗阳刘琦
- 关键词：DOC-1R基因敲除慢病毒
- DOC-1R基因重组表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达被引量：1
- 2012年
- 目的 构建人DOC-1R基因重组逆转录病毒表达载体,实现该基因在体外培养细胞中的大量表达,从而研究表达蛋白的功能。方法 通过重组技术将含有FLAG标签序列的DOC-1R cDNA编码区全长克隆至逆转录病毒载体pLXSN,菌落PCR鉴定、限制性内切酶双酶切及测序验证重组载体的构建。将重组载体转染至GP-293细胞进行病毒包装并以所包装的病毒感染HeLa细胞,通过Western blot及间接免疫荧光染色检测重组DOC-1R蛋白的表达及细胞内定位。结果 测序结果表明重组载体中插入的重组片段序列及开放阅读框架正确,逆转录病毒表达载体pLXSN-FLAG-DOC-1R成功构建。Western blot及间接免疫荧光染色结果证实,逆转录病毒介导的重组DOC-1R蛋白在HeLa细胞中高效表达,表达效率明显高于真核表达载体介导的重组蛋白表达。结论 DOC-1R基因逆转录病毒表达载体成功构建,重组蛋白在体外培养细胞正确高效表达。
- 刘琦刘杏高锦兰胡西华罗阳
- 关键词：DOC-1R转染
- DOC-1R蛋白对细胞周期调控作用的研究
- 刘琦罗阳王述森刘杏高锦兰
- 关键词：DOC-1R
- DOC-1R缺失型原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化
- 2018年
- 目的构建DOC-1R(deleted in oral cancer-I related)缺失型原核表达载体并纯化其重组蛋白,用于进一步研究DOC-1R互作蛋白及DOC-1R与其相互作用区域。方法经基因重组技术构建分别缺失DOC-1R N端1/3序列及其C端1/3序列的原核表达载体,经测序鉴定、转化至E.coli BL21菌株后,诱导表达两种缺失型GSTDOC-1R重组蛋白,并获得纯化的重组蛋白。结果两载体克隆序列及开放阅读框架均正确,经IPTG诱导在35kD处获得重组蛋白,纯化后得到大量GST-DOC-1R缺失型重组蛋白。结论成功构建了两种pGEX-DOC-1R缺失型原核表达载体,表达并纯化出GST-DOC-1R delN42、GST-DOC-1R delC42融合蛋白。
- 沈飞高锦兰王述森王世全罗阳刘琦
- 关键词：DOC-1R重组蛋白
- Cyclin G2参与雌激素调控细胞成骨分化的分子机制研究
- Cyclin G2是细胞周期和细胞增殖的负性调控因子，其表达受雌激素调节。有研究报道cyclin G2能够通过PPAR γ调节细胞成脂分化及脂滴形成，提示其可能参与细胞的成骨调控。我们在具有成骨分化能力的细胞中添加雌激素...
- 高锦兰张欣馨邢雪莎杨春花罗阳
- 关键词：雌激素成骨分化
- 母体慢性铝暴露对子代鼠海马LTP的损害作用
- 2009年
- 目的探讨母体于孕前、孕期和哺乳期不同浓度的铝暴露对子代大鼠海马CA3-CA1通路诱导的LTP的影响。方法从孕前30d始至子代断乳止,对照组饮用蒸馏水,低剂量(0.2%Al)和高剂量(0.4%Al)暴露组的母代大鼠分别和铝离子(Al3+)浓度为0.074mol·L-1(2g·L-1)、0.148mol·L-1(4g·L-1)的三氯化铝(AlCl3)蒸馏水溶液;采用石墨炉原子吸收法测定子代鼠的脑铝及血铝含量;采用细胞内记录方法测定子代鼠海马CA3-CA1通路诱导的LTP。结果两暴露组大鼠的血铝和脑铝平均含量明显高于对照组(P<0.05及P<0.01);高频刺激后,两暴露组群体锋电位(PS)幅值增强率(相对于基线值的百分数)逐渐减小,与对照组相比差异非常显著(P<0.01),但两铝暴露组之间差异不显著。结论母体不同浓度的慢性铝暴露可使PS幅值增强率减小,提示铝暴露损害了子代大鼠LTP的诱导与维持。
- 刘慧慧刘利丹王德山高锦兰时利德
- 关键词：铝暴露LTP
