柳琨
- 作品数：5 被引量：12H指数：2
- 供职机构：武汉大学中南医院更多>>
- 发文基金：湖北省自然科学基金国家自然科学基金武汉市科技攻关计划项目更多>>
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- pCGN-HAM-N1-wcAPC质粒的构建及其功能
- 2013年
- 目的 构建带有HAM标签的真核表达重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC及探讨其功能.方法 制备高效率感受态；用聚合酶链反应（PCR）扩增,将腺瘤息肉病（APC）基因截短的片段APC1克隆于T载体；同时将pCMV-neo-bam-APC酶切,得到APC基因的另一个8300 bp截短片段kAPC亚克隆于pCGN-HAM-N1真核表达载体,得重组质粒pCGN-HAM-N1-kAPC；再运用双酶Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ同时酶切TA克隆、pCGN-HAM-N1-kAPC,将APC1片段插入载体pCGN-HAM-N1-kAPC,获含野生型全长APC基因重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC.用酶切,测序鉴定.脂质体法分别将含全长,截短的重组质粒,空载体与WNT信号系统的β-连环蛋白（β-catenin）、topflash和荧光素酶共同转染293T细胞,利用双荧光报告测试系统,检测转染后荧光素酶活性.结果 重组质粒经酶切其大小与预期一致,经测序比对证实与GeneBank中给出的序列一致.转染pCGN-HAM-N1-wcAPC组的荧光素酶活性明显低于转染空载体组pCGN-HAM-N1（P＜0.05）.结论 含野生型全长9000 bp大片段APC基因分段成功插入pCGN-HAM-N1载体,带有HAM标签的真核表达重组质粒pCGN-HAM-N1-wcAPC构建成功,pCGN-HAM-N1-wcAPC抑制T细胞因子/淋巴增强因子（Tcf/Lef）启动子的活性.
- 方喜平冯茂辉谢伟王国洲陈双倩阳芳柳琨杨倩陈大平
- 关键词：重组质粒
- 特异结合唾液酸化LewisX抗原DNA适配子抑制肝癌细胞株HepG2体外侵袭转移被引量：2
- 2011年
- 目的观察特异结合唾液酸化LewisX（SLeX）抗原DNA适配子抑制HepG2细胞与E一选择素黏附能力及其体外抑制HepG2细胞浸润转移能力。方法采用黏附实验、Transwell体外侵袭实验，检测该适配子对HepG2细胞与E选择素黏附及对HepG2细胞体外侵袭的影响。结果该DNA适配子可有效抑制HepG2细胞与E-选择素黏附，黏附细胞数随适配子浓度的增加而减少（P〈0．01），20nmol浓度的适配子与单克隆抗体CSLEX-1效果相似；Transwell侵袭实验中，5、10、20nmo]适配子组的侵袭细胞数分别为159．00±3．27、142．00±5．50、115．00±5．07，与对照组（178．00±4．64）比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论特异结合唾液酸化LewisX抗原DNA适配子町以抑制HepG2细胞与E-选择素黏附，阻断Lewis-selectin途径，抑制HepG2细胞体外侵袭转移。
- 彭艳谢伟汪付兵阳芳柳琨方喜平段丽吴红艳冯茂辉
- 瘤体内直接注射白细胞介素-7基因抗小鼠乳腺肿瘤免疫效应的研究被引量：2
- 2012年
- 目的观察瘤体内直接注射白细胞介素（IL）-7基因抗小鼠乳腺肿瘤免疫效应。方法构建IL-7真核表达质粒（pcDNA3-IL-7）；建立乳腺癌TM40D细胞BALB／C小鼠移植模型；瘤体内直接注射pcDNA3-IL-7，观察小鼠肿瘤体积变化；酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测外周血干扰素（IFN）-γ含量；流式细胞仪检测胞内IFN-γ的分泌量；局部肿瘤经治疗后行常规病理分析。结果成功构建pcDNA3-IL-γ；与对照磷酸盐缓冲液（PBS）组（115．2±11．8）ng／L、pcDNA3组（133．6±9．4）ng／L比较，pcDNA3-IL-7注射组（242．3±10．1）ng／L外周血IFN-γ明显增高；pcDNA3-IL-γ明显抑制肿瘤生长（P〈0．05）；流式细胞仪检测显示pcDNA3-IL-7显著促进CD4＋T细胞、CD8＋T细胞内IFN-γ的分泌量；常规病理显示pcDNA3-IL-7注射组肿瘤组织大量坏死，炎性细胞和大量淋巴细胞浸润。结论瘤体内直接注射pcDNA3-IL-7明显抑制小鼠乳腺肿瘤生长，显著促进IFN-γ分泌，增强了小鼠机体抗乳腺肿瘤的免疫效应。
- 汪付兵陈志芬陈大平柳琨阳芳冯茂辉谢伟朱尤庆夏冰
- 关键词：白细胞介素-7干扰素-Γ抗肿瘤免疫
- 突变型p53蛋白DNA适配子的体外筛选与鉴定被引量：7
- 2011年
- 目的 建立体外获得突变型p53蛋白DNA适配子（aptamers）的方法,为该适配子在肿瘤早期诊断及靶向治疗运用中奠定基础.方法 构建长度为75 nt的初始随机单链DNA库,其两端为固定序列,中间为35个随机序列,库容量为1 × 1017～1×1018,以溴化氰活化的琼脂糖小球为筛选介质,运用指数富集的配体系统进化技术（SELEX技术）经逐轮筛选获得突变型p53蛋白的DNA适配子.将适配子库克隆、测序,采用DNAMAN软件对其结构进行分析,通过生物素-亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定适配子与突变型p53蛋白的亲和力.结果 经逐轮筛选,所得适配子富集库与突变型p53蛋白的亲和力逐步提高,A450值从0.1357增加到了0.6818,其亲和力至第8轮筛选达最高水平后进入平台期.克隆第8轮筛选适配子库,测定23个克隆子的序列,其中20个克隆子的序列与预期相符.DNAMAN5.29软件分析表明,20个克隆子的一级序列同源率为76.51%,无共同保守序列,适配子的二级结构则以茎环、凸环结构为主.结论 经8轮筛选获得的DNA适配子与突变型p53蛋白的体外结合具有高度的特异性及亲和力,其克隆子无共同保守序列,适配子的高亲和性与其形成的茎环、凸环等空间结构密切相关.
- 段丽冯茂辉阳芳谢伟彭艳吴红艳柳琨方喜平汪付兵
- 关键词：适配子P53蛋白SELEX技术
- 唾液酸化Lewis X抗原DNA适配子体外抑制乳腺癌细胞侵袭转移被引量：3
- 2013年
- 目的 观察特异结合唾液酸化Lewis X抗原（SLeX） DNA适配子抑制MDA-MB-231细胞与E-选择素黏附能力及其体外抑制MDA-MB-231细胞浸润转移能力.方法 采用体外细胞黏附实验、Transwell小室侵袭实验,检测E-选择素及唾液酸化Lewis X的DNA适配子对肿瘤细胞黏附力、侵袭力的影响.结果 该DNA适配子可以有效的抑制MDA-MB-231细胞与E-选择素黏附,对E-选择素处理过的MDA-MB-231,随着适配子浓度的增加,其抑制细胞黏附的作用越强,抑制率（％）分别为15.54 ±6.10、39.69±5.69、62.15±5.44；适配子组（200 μmol/L）吸光度（A）值与SLeX抗体（1∶100）组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,说明其抑制黏附作用较抗体强.E-选择素预先处理过的Transwell侵袭实验中,各适配子组（50、100、200 μmol/L）穿膜细胞数分别为（199.3±3.2）、（178.7±3.5）、（168.3±4.2）个（F=88.6,P＜0.05）；两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）,说明随着SLeX适配子浓度的增高,抑制细胞侵袭的作用越强,抑制率依次为（25.13±5.05）％、（57.59±5.52）％、（73.83 ±6.54）％；适配子组（200 μmol/L）较SLeX抗体（1∶ 100）组穿膜细胞数少（P＜0.05）,说明适配子比抗体抑制侵袭作用强.结论 特异结合SLeX DNA适配子可以抑制MDA-MB-231细胞与E-选择素黏附,阻断Lewis-selectin途径,抑制MDA-MB-231细胞体外侵袭转移.
- 阳芳冯茂辉谢伟陈双倩王国洲陈大平杨倩方喜平柳琨
- 关键词：唾液酸化LEWISX抗原乳腺癌
