李文超
- 作品数：11 被引量：20H指数：3
- 供职机构：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家公益性行业科研专项国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 小反刍兽疫P基因的克隆及其蛋白结构和B细胞表位的预测
- 本试验以小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株为研究对象,通过RT-PCR法扩增P基因,利用DNAStar软件包中的Editseq将Nigeria75/1株苷酸序列翻译成氨基酸序列,然后利用Protean软件对其氨基酸序...
- 金红岩封家旺隋修锟李文超黄华欣李刚
- 关键词：小反刍兽疫基因克隆蛋白结构
- 文献传递
- TaqMan荧光定量PCR检测鸡产蛋下降综合征病毒方法的建立及应用被引量：3
- 2012年
- 根据GenBank公布的鸡产蛋下降综合征病毒六邻体蛋白基因的高度保守序列,设计了2对特异性引物和1条TaqMan探针。以构建的阳性重组质粒为标准品,绘制标准曲线,建立了一种快速检测鸡产蛋下降综合征病毒的TaqMan荧光实时定量PCR方法。该方法最小检出量达10copies.μL-1,在1.0×102～1.0×108copies.μL-1检测范围间有良好的线性关系,特异性、稳定性和重复性也较好。用建立的本方法检测感染鸡产蛋下降综合征病毒鸡群的产蛋分离物,与普通PCR相比,该荧光实时定量PCR方法具有更高的敏感性,可更好地用于鸡产蛋下降综合征病毒的临床检测。
- 马震原李刚李文超郭宇飞
- 关键词：TAQMAN探针荧光实时定量PCR
- 检测鸡产蛋下降综合征病毒的方法及其试剂盒
- 本发明提供了一种检测鸡产蛋下降综合征病毒的方法及其试剂盒。通过对鸡产蛋下降综合征病毒基因测序和比对，提供了用于检测鸡产蛋下降综合征病毒的遗传标记物、实时荧光定量PCR引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，...
- 李刚马震原李文超
- 小反刍兽疫病毒M蛋白主要抗原表位区的原核表达及鉴定被引量：8
- 2013年
- 为了制备小反刍兽疫病毒(PPRV)特异性单抗及临床抗体水平监测,通过在线软件分析PPRVNigeria75/1株M蛋白可能包含的B细胞线性表位位点,结合可溶性预测,设计1对引物,扩增303bp目的基因。将目的基因克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,用IPTG诱导表达,纯化,SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定结果显示,所构建的重组蛋白以可溶性形式高效表达并具有良好的反应原性,为制备特异性单抗及包被抗原用于PPRV抗体水平监测奠定了一定基础。
- 黄华欣李刚史利军赵占中王勇金红岩李文超陶春爱隋修锟
- 关键词：小反刍兽疫M蛋白抗原表位原核表达
- 小反刍兽疫病毒H基因DNA疫苗的构建及对小鼠的免疫原性
- 2014年
- 旨在构建表达小反刍兽疫病毒(PPRV)H蛋白的核酸疫苗,并评价其对小鼠的免疫原性。利用RT-PCR扩增了PPRV的H基因并将其克隆到pcDNA3.1(+)载体中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-H,然后转染鸡胚成纤维(CEF)细胞,采用间接免疫荧光和Western blot检测H蛋白的瞬时表达情况。将重组质粒通过后腿肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA、淋巴细胞增殖试验和细胞因子检测评价该DNA疫苗的免疫效果,结果表明,成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1-H,并且能够在CEF细胞中表达。免疫小鼠后,pcDNA3.1-H能够诱导小鼠产生较高的特异性抗体水平,DNA疫苗免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖试验刺激指数(SI)均高于空载体和PBS免疫组,并且能够分泌较高水平的IFN-γ和IL-4。因此,制备的DNA疫苗免疫小鼠后可诱导体液免疫应答和细胞免疫应答,具有较好的应用前景。
- 李文超隋修锟金红岩梁琳王文泉李刚
- 关键词：小反刍兽疫病毒DNA疫苗H基因免疫原性
- 小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株磷蛋白的表达及磷酸化位点的预测被引量：3
- 2013年
- 为深入研究小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)P蛋白对病毒复制的影响,以小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株为研究对象,通过RT-PCR法扩增P基因,将扩增出的P基因克隆到pGEX-6P-1原核表达载体中,成功构建pGEX-6P-1-PPRV-P表达载体,测序鉴定无误后转化至表达宿主菌BL21(DE3)plysS中进行IPTG诱导表达,并通过在线软件预测了P蛋白的磷酸化位点。结果显示,pGEX-6P-1-PPRV-P重组菌在IPTG浓度1.0mmol/L时经37℃诱导4h,目的基因可正确表达,并以可溶性的形式存在。经Western-blot鉴定,目的蛋白可与PPRV Nigeria75/1株病毒小鼠阳性血清发生特异性的免疫印迹反应,证明表达的蛋白具有较好的反应原性。经综合预测分析,可能被磷酸化的位点有46个,其中PKC、PKA、CKII/CKI、cdc2可能作用的位点分别为15个、7个、10个、6个,其他激酶作用位点可能为8个。结果表明,P蛋白的克隆表达及磷酸化位点的成功预测为小反刍兽疫病毒的深入研究奠定了基础。
- 金红岩封家旺李文超程朝飞隋修锟黄华欣李刚
- 关键词：小反刍兽疫病毒原核表达磷酸化位点
- 检测鸡产蛋下降综合征病毒的方法及其试剂盒
- 本发明提供了一种检测鸡产蛋下降综合征病毒的方法及其试剂盒。通过对鸡产蛋下降综合征病毒基因测序和比对，提供了用于检测鸡产蛋下降综合征病毒的遗传标记物、实时荧光定量PCR引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，...
- 李刚马震原李文超
- 文献传递
- 抗小反刍兽疫病毒P蛋白单链抗体的制备及鉴定被引量：1
- 2016年
- 为制备抗小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria75/1株P蛋白的单克隆抗体并获得其单链抗体(ScFv)基因,利用纯化的PPRV和带有GST标签的重组P蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗PPRV P蛋白的单克隆抗体(m Ab),从分泌抗PPRV P单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,扩增VH基因和VL基因,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法获得单链抗体全长基因,并克隆至原核表达载体p ET32a(+)中,再将构建的重组质粒p ET32a-ScFv-3A6转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导单链抗体重组蛋白表达。结果,获得了4株能稳定分泌抗PPRV P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株3A6、1P4、3F8和1P1,对m Ab 3A6进行了Western-blot鉴定和间接免疫荧光试验(IFA)。成功扩增了杂交瘤细胞株3A6的ScFv基因,获得了ScFv-3A6重组蛋白,大小为47 ku,证实该重组蛋白具有较强的抗原结合活性。上述研究结果表明,本研究获得了4株能稳定分泌抗PPRV P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,并成功扩增到杂交瘤细胞株3A6的ScFv基因,实现了原核表达,为PPR防控新措施的研究奠定了基础。
- 金红岩隋修锟刘欢李文超梁琳赵玲娜温施慧Zheney Makay李刚
- 关键词：小反刍兽疫病毒单链抗体原核表达
- 小反刍兽疫病毒抗体间接ELISA检测方法的建立被引量：1
- 2014年
- 为建立一种能快速、特异、敏感地检测血清中小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体的方法,通过RT-PCR方法扩增出1 830bp的小反刍兽疫病毒的H基因,并将其克隆至原核表达载体pET-22b(+)中,进行H基因的重组表达。采用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。用纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。通过矩阵法优化抗原最佳包被浓度、血清稀释度、最佳封闭剂、酶标二抗的最佳稀释度及孵育时间。结果显示,重组H蛋白(分子质量为68ku)能与PPRV阳性血清发生特异性反应。用建立的间接ELISA与标准竞争ELISA试剂盒检测92份临床样品并进行比较,两者的符合率为94.11%。结果表明,本研究建立的间接ELISA可以用于临床PPRV抗体的检测。
- 隋修锟金红岩李文超梁琳李刚
- 关键词：小反刍兽疫病毒间接酶联免疫吸附试验
- 小反刍兽疫病毒H基因在杆状病毒中的表达及其免疫原性研究被引量：5
- 2014年
- 为表达小反刍兽疫病毒(PPRV)H蛋白,并探讨其免疫原性,通过RT-PCR克隆PPRV Nigeria75/1毒株H基因,将其克隆至供体质粒pFB-LIC-Bse中,测序验证后将重组质粒pFB-LIC-Bse-PPRV-H转化至DH10Bac感受态细胞中,经同源重组获得重组杆状病毒穿梭质粒bacmid-PPRV-H,将其转染昆虫细胞sf21获得含有PPRV H基因的重组杆状病毒。采用SDS-PAGE、Western blot、IFA及小鼠免疫试验鉴定表达产物的反应原性及免疫原性。结果表明,在杆状病毒表达系统中表达的PPRV H蛋白能与His-tag单克隆抗体及PPRV阳性血清发生特异性反应,其相对分子质量为68ku;表达产物接种小鼠可诱导其产生特异性抗体和抗小反刍兽疫病毒中和抗体,淋巴细胞增殖试验检测结果表明重组杆状病毒rBacmid-H能与相应抗体和致敏的效应淋巴细胞发生较强的特异性反应。本试验获得的重组杆状病毒表达的PPRV H蛋白具有良好的免疫原性及反应原性,可诱导小鼠产生保护性中和抗体,该试验为进一步开发小反刍兽疫亚单位疫苗奠定了基础。
- 隋修锟金红岩李文超史利军赵占中梁琳李刚
- 关键词：小反刍兽疫病毒杆状病毒表达系统
