吕自力
- 作品数：5 被引量：2H指数：1
- 供职机构：石河子大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金“十一五”科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 牛输卵管上皮细胞转人胶原蛋白cDNA基因及转基因克隆胚胎
- 2012年
- 以2岁奶牛输卵管为材料,用胰酶消化法分离得到了牛输卵管上皮细胞。输卵管上皮细胞在DMEM/F12培养基中生长良好。用一代牛输卵管上皮细胞为靶细胞,对其进行了电穿孔转染,转染对象是分子大小为31 085bp的以β-casein启动子为基础的含有人胶原蛋白cDNA基因和EGFP、Neor双标记基因的质粒。电穿孔试验发现,牛输卵管上皮细胞在低渗缓冲液中电转染可以获得阳性转染子,其中以90mOsm/kg为最佳。电压以800V为好,电压高和低都不利于电穿孔的成功。成功转染的细胞用800mg/L G418进行筛选,在10d后获得了较大的阳性细胞克隆簇。对获得的阳性细胞克隆簇进行扩大后,得到了较纯的阳性细胞克隆系,流式细胞仪检测其纯度为81.6%。在荧光显微镜下选择阳性细胞作为核移植供体细胞进行了转基因克隆试验,结果显示以转基因和非转基因细胞为核供体获得的重构胚融合率差异显著(51.9%比63.2%),获得的桑椹胚/囊胚率差异不显著(20.3%比25.5%)。对获得的具有绿色荧光的胚胎进行DNA分析,结果显示这些胚胎成功转入了外源基因,并且转入的外源基因结构完整。
- 吕自力王亮刘婷婷石国庆
- 关键词：输卵管上皮细胞电穿孔胶原蛋白转基因克隆
- 牛卵丘细胞的生长特征与转基因
- 2011年
- 目的了解牛卵丘细胞的生长特征及构建的基因载体对卵丘细胞的转染情况和转染后阳性细胞的扩增效率。方法用透明质酸酶消化牛卵丘/卵母细胞复合体(COCs)获得牛卵丘细胞,了解牛卵丘细胞的生长特点,并用分子大小分别为7178 bp和31 085 bp两种带有增强绿色荧光蛋白(EGFP)和新霉素抗性基因(Neor)的质粒载体pMSCV-EGFP-Neor和pGC1-collagen-EGFP-Neor分别转染靶细胞。结果用脂质体法转染对数生长期的细胞,均获得了绿色荧光阳性细胞,但小质粒的转染效率在72 h时是大质粒的6倍(14%vs.2.3%)。在800μg/mLG418筛选浓度下,14 d后分别获得了7个和3个较明显的单克隆细胞群,对它们进行挑选、扩大,都获得了较纯的单克隆细胞系。最后根据EGFP和collagen的已知基因序列对转染pGC1-collagen-EGFP-Neor质粒的阳性细胞进行三个不同区域DNA片段的扩增,结果表明,扩增的基因片段大小正确,数目完整。结论对卵丘细胞进行基因转染,分子大小等于或小于31 kb的基因可以有效转入,但小分子载体比大分子载体具有更高的转染效率。经过筛选都可以获得纯的转基因细胞系。
- 吕自力王亮石国庆
- 关键词：卵丘细胞细胞培养脂质体细胞转染转基因
- 不同冷冻方法对牛卵母细胞及孤雌胚发育的影响
- 2010年
- 研究了麦管和OPS管法冷冻以及OPS法中保护剂种类对牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响。结果发现,OPS管冷冻牛卵母细胞形态正常率、卵裂率、囊胚率极显著高于麦管法(P<0.05)。在OPS法中,应用两种保护剂冷冻后,卵母细胞形态正常率、卵裂率、囊胚率差异极显著(P<0.01);采取38℃与25℃温度平衡,冷冻后卵母细胞各发育指标差异不显著(P>0.05);采用4℃平衡,冷冻后的卵母细胞激活后没有出现囊胚,各发育指标极显著降低(P<0.01)。结果表明,OPS法可以有效地保护卵母细胞,保证其后孤雌激活;采用低温平衡会对孤雌发育的囊胚阶段有较大影响。
- 卞江涛倪明胡高博赵鑫吕自力卢全晟薛利宋彦军张居农
- 关键词：冷冻方法牛卵母细胞体外成熟
- 奶牛体细胞的纯化与人COL1α1 cDNA转染及核移植胚胎发育研究
- 乳腺生物反应器(mammary gland bioreactor),或称动物个体乳腺表达系统,是指利用乳腺特异表达的乳蛋白基因调控序列构建表达载体,制作转基因动物,指导特定外源基因在动物乳腺中特异、高效率地表达,以期从分...
- 吕自力
- 关键词：乳腺生物反应器细胞转染转基因克隆
- 文献传递
- 牛输卵管上皮细胞的纯化培养与生长特性研究被引量：2
- 2011年
- 研究依据牛输卵管上皮细胞与成纤维细胞对EDTA/胰酶消化敏感性不同,分离纯化牛输卵管上皮细胞,并以其进行生长曲线和细胞凋亡趋势的研究。结果表明:荷斯坦奶牛输卵管上皮细胞在DMEM/F12培养基中生长旺盛,第3代细胞在2.5×104个细胞/孔的起始浓度下,生长周期明显,7 d左右可以达到100%汇合。第11代细胞达到100%汇合的时间较第3代细胞延长3 d左右,细胞出现滞长现象。用膜联蛋白V-FITC/PI双标记流式细胞术检测输卵管上皮细胞凋亡,发现输卵管上皮细胞在生长期细胞凋亡速度慢,在接触生长期中短期内饥饿培养对凋亡影响不大。9代以前细胞凋亡率每代增加约1%左右,但9代后凋亡率明显加快,在9代时为15.5%,11代时已经达到了20.7%,13代为26.4%。因为细胞凋亡时细胞的核质出现退化,提示以输卵管上皮细胞作为核移植供体材料或建立早期胚胎发育的共培养体系时,应该使用10代以前的细胞为宜。
- 吕自力石国庆王亮
- 关键词：输卵管上皮细胞细胞培养细胞凋亡
