习彩霞
- 作品数：10 被引量：9H指数：2
- 供职机构：解放军第307医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的表达优化被引量：2
- 2005年
- 目的:我们所研创的pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21pLysE工程菌通常情况下更多的是以包涵体形式为主,而少部分为可溶形式,本研究试图在不改变其结构而仅通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素而获得稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白。方法:针对更换不同的培养基、降低或升高诱导温度、增加或减少IPTG的用量、延长或缩短诱导时间等诸多能够增加可溶性表达量的各种因素进行较为系统的探索。结果:该工程菌在无压力选择条件下传代50代后的表达稳定性约为60%;通过大量对比研究,我们最终确定了pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21pLysE菌种的最佳培养诱导表达方案:即过夜活化的菌种以2%浓度接种于2YT培养基,22℃培养至D值约为0.4时加入0.1mmol/LIPTG,诱导12h,由此可获得较高水平的、稳定的、几乎全部为可溶性表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白,目的蛋白量占菌体总蛋白的≥24%。结论:通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素,获得了稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的工程菌,为进一步有效分离纯化该蛋白奠定了基础。
- 关海容孙玉英袁志宏张惠丽梁飞刘楠郭斯启习彩霞奚永志
- 关键词：工程菌株免疫抑制基因表达
- 一种编码鸡Ⅱ型胶原蛋白的全长多核苷酸序列及其用途
- 本发明涉及一种包含如SEQ ID NO：1所示编码全长鸡II型胶原蛋白的多核苷酸序列之核酸分子，或其具有相同生物学功能的片段；及其所编码的鸡II型胶原蛋白。本发明还涉及一种制备所述鸡II型胶原蛋白的方法，以及由本发明所述...
- 奚永志习彩霞
- 文献传递
- 一种编码鸡Ⅱ型胶原蛋白的全长多核苷酸序列及其用途
- 本发明涉及一种包含如SEQ ID NO：1所示编码全长鸡II型胶原蛋白的多核苷酸序列之核酸分子，或其具有相同生物学功能的片段；及其所编码的鸡II型胶原蛋白。本发明还涉及一种制备所述鸡II型胶原蛋白的方法，以及由本发明所述...
- 奚永志习彩霞
- 文献传递
- 重组人干细胞因子／血小板生成素融合基因的克隆、表达及其蛋白质结构预测
- 2005年
- 目的:获得重组人干细胞因子／血小板生成素(SCF-TPO)融合蛋白的高表达,预测该全新型融合蛋 白的蛋白质结构。方法:设计引物,利用RT-PCR从胎肝细胞中扩增SCF和TPO氨基端功能区片段,采用基因融合 新策略将其融合成SCF-TPO融合基因,构建pET32a／SCF-TPO融合基因重组表达载体,在E．coli BL21(DE3)plysS 中获得正确高表达,采用生物信息学方法对融合蛋白的结构特征进行模拟分析。结果:首次成功构建了pEF32a／SCF -TPO原核表达载体,并获得了融合蛋白的高表达,表达量高达40％,主要以包涵体形式表达。蛋白结构预测结果 显示,融合蛋白的等电点、抗原性及亲水性无显著改变,接头序列具有高柔性。融合蛋白除一级结构有4个氨基酸发 生改变外,原来的α螺旋和β片层无改变。结论:获得了SCF-TPO融合蛋白的高表达,结构预测融合蛋白的设计符 合要求。为进一步研究SCF-TPO融合蛋白的生物学特性奠定了基础。
- 刘楠奚永志郭斯启孙玉英袁志宏崔建武习彩霞梁飞孔繁华
- 关键词：干细胞因子原核表达蛋白质结构
- 新型重组融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL部分表征的鉴定
- 2008年
- 目的:对构建的新型重组B7-2-PE40KDEL外毒素融合蛋白的部分表征进行分析鉴定。方法:采用SDS-PAGE相对分子量、胰蛋白酶消化的MALDI-TOF-MS质谱、蛋白印迹、全波长扫描和MTT法分别测定该融合蛋白相对分子量、肽谱、抗原特异性以及靶向杀伤生物学活性。结果:B7-2-PE40KDEL经12%SDS-PAGE蛋白电泳和凝胶成像系统分析计算,其相对分子量为72628,与理论预测值69561相比误差在5%之内;全波长扫描分析显示该目的蛋白分别在225nm和276nm处各有一吸收峰;MALTI-TOF-MS质谱测定共获得15个与理论预测值相符的肽段,经瑞士生物信息研究所的EXPASY分子生物服务网站的Peptident数据库搜索证明,在分子量为60000～80000的范围内未检索到与上述条件相符的已知蛋白,证明本融合蛋白为全新蛋白,与我们预测的目的蛋白相符;Westernblot实验显示B7-2-PE40KDEL能与人B7-2及PEA抗体特异性结合;MTT杀伤活性测定表明,该融合蛋白对表达CD28+的人T淋巴瘤细胞系Jurkat产生特异性杀伤,而对不表达的CD28-淋巴细胞系Raji无任何杀伤。结论:重组B7-2-PE40KDEL外毒素融合蛋白为一全新的具有靶向B7:CD28细胞杀伤活性的蛋白质。
- 关海容孙玉英袁志宏张惠丽梁飞刘楠郭斯启习彩霞奚永志
- 关键词：肽谱抗原特异性生物学活性
- 重组人干细胞因子-血小板生成素融合蛋白的表达及活性初步研究
- 2005年
- 目的研究重组人干细胞因子血小板生成素(SCFTPO)融合蛋白表达的最佳条件及其生物学活性。方法设计引物,利用RTPCR从胎肝细胞中扩增到SCF和TPO氨基端功能区片段,采用基因融合新策略将其融合成SCFTPO融合基因,克隆到pGEMT载体中,构建pET32a/SCFTPO融合基因原核表达载体,在宿主菌E.coliBL21(DE3)plysS中经异丙基βD硫代半乳糖(IPTG)诱导其高表达SCFTPO,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot检测。目的蛋白经包涵体变性,金属螯合层析纯化,透析复性,用细胞因子依赖细胞系MO7e进行细胞增殖实验。结果获得SCFTPO融合基因的高表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。Westernblot法鉴定表达正确,MTT法证明该融合蛋白具有细胞增殖活性,浓度为100ng/ml时刺激活性更强。结论表达并复性后的重组人SCFTPO融合蛋白具有刺激MO7e细胞生长活性。
- 刘楠奚永志郭斯启孙玉英袁志宏崔建武习彩霞梁飞孔繁华
- 关键词：SCF血小板生成素TPO活性复性IPTG
- 一种编码鸡Ⅱ型胶原蛋白的全长多核苷酸序列及其用途
- 本发明涉及一种包含如SEQ ID NO：1所示编码全长鸡II型胶原蛋白的多核苷酸序列之核酸分子，或其具有相同生物学功能的片段；及其所编码的鸡II型胶原蛋白。本发明还涉及一种制备所述鸡II型胶原蛋白的方法，以及由本发明所述...
- 奚永志习彩霞
- 文献传递
- 重组人干细胞因子在原核系统中高效表达的策略被引量：3
- 2004年
- 目的 探索并建立人干细胞因子 (SCF)的原核高效表达系统。方法 设计特异性引物 ,以RT PCR从人胎肝组织中扩增出干细胞因子的膜外区活性片段 ,克隆进入pGEM T载体。以Goldkey软件进行翻译起始序列RNA结构和自由能优化 ;通过合成寡核苷酸和PCR技术将SCFcDNA中的原核稀有密码子定点突变为同义的高频密码子 ;酶切连接构建多种原核表达载体并比较它们在宿主菌中诱导表达结果。表达产物经SDS PAGE、WesternBlot和MTT活性鉴定。结果 扩增SCF膜外区序列测定正确。构建的原核表达载体 pET32a(+) SCF在大肠杆菌中获得高效融合表达 ,表达产量达 30 %以上 ,WesternBlot鉴定正确 ,初步纯化产物的活性与标准品相似。结论 根据使用的载体 /宿主系统 ,翻译起始序列 (TIS)的RNA结构和自由能优化、稀有密码子突变对表达无影响 ;SCF基因在 5′端融合要比
- 郭斯启奚永志崔建武习彩霞刘楠梁飞孔繁华
- 关键词：干细胞因子大肠杆菌
- 重组人干细胞因子/血小板生成素融合蛋白的纯化及复性研究被引量：3
- 2005年
- 目的 探讨重组人干细胞因子/血小板生成素(SCF TPO)融合蛋白纯化及复性的最佳方法。方法 裂解 法提取包涵体,在变性条件下利用金属螯和层析获得融合蛋白,经透析及谷胱甘肽氧化还原法对纯化的融合蛋白进 行复性。结果 获得具有初步生物学活性的SCF TPO融合蛋白,其纯度高达90%。结论 该纯化方法操作简捷, 特异性高,纯化效果好,获得率高。
- 刘楠奚永志孙玉英郭斯启袁志宏崔建武习彩霞梁飞孔繁华
- 关键词：包涵体纯化复性
- 新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的分离纯化被引量：2
- 2006年
- 为了建立高效快捷能分离大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯化路线,比较了不同组合的纯化策略和条件,包括反相层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、蓝染料亲和层析和凝胶过滤层析等,并采用MTT法检测该融合蛋白的靶向杀伤活性。结果表明,在反相层析分离中疏水相分别采用了常规的甲醇和乙腈,结果为所分离的该重组融合蛋白均发生了变性,从色谱柱中分离出来就生成了絮状沉淀。在蓝染料亲和层析一步分离中,由于全菌体蛋白中与亲和树脂发生非特异结合的成分较多,极难区分目的蛋白和杂蛋白。但是,PRSETA-B7-2-PE40KDEL表达载体上带有翻译增强序列T7-g10,可在表达目的蛋白N端融合6个组氨酸,这十分有利于通过Ni-NTA金属鏊和层析法快速高纯度地纯化表达产物。根据这一特性,经反复筛选实验设计最终确定了金属螯合层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步法的纯化路线,用于纯化分离B7-2-PE40KDEL融合蛋白。所得的目的蛋白的纯度可达95%以上,总回收率为8%。Western-blot实验显示,所得蛋白可与B7-2及PEA抗体特异性结合;MTT生物活性测定表明,该融合蛋白对表达CD28受体的人T细胞系Jurkat产生特异性杀伤作用,而对不表达CD28的淋巴细胞系Raji无任何杀伤作用。结论:建立了高效快速纯化大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的技术路线,所纯化的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白能特异性靶向杀伤表达CD28受体的人T细胞。
- 关海容孙玉英袁志宏张惠丽梁飞刘楠郭斯启习彩霞奚永志
- 关键词：蛋白纯化靶向杀伤生物活性
