黄保丁
- 作品数：15 被引量：28H指数：3
- 供职机构：中山大学附属第六医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省科委重点攻关项目东莞市高等院校科研机构科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生文化科学更多>>
- 低氧诱导因子1α及2α在人BMSCs成软骨分化中的表达规律被引量：3
- 2015年
- 目的通过诱导人BMSCs(human BMSCs,hBMSCs)成软骨分化,观察低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)、HIF-2α在分化过程中的表达趋势,为阐明HIF参与调控成软骨分化机制提供依据。方法对已消化的悬浮hBMSCs进行离心沉淀,形成细胞微球。将细胞微球分为2组,对照组加入含2%FBS的H-DMEM培养基,成软骨诱导组加入软骨诱导液,于低氧(2%O2)条件下培养。培养3周后行甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,培养1周行Western blot检测HIF-1α、HIF-2α蛋白表达,培养1、2、3周行实时定量PCR检测成软骨分化关键转录因子及相关标志基因表达。结果甲苯胺蓝染色示,对照组染色细胞核整体分布稀疏,而成软骨诱导组分布致密;成软骨诱导组细胞外基质染色明显较对照组深。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示阳性信号主要位于细胞质内;与成软骨诱导组相比,对照组细胞核分布较稀疏且着色浅。Western blot检测示,培养1周成软骨诱导组HIF-1α和HIF-2α蛋白相对表达量均显著低于对照组(t=8.345,P=0.001;t=7.683,P=0.002)。实时定量PCR检测示,与对照组比较,成软骨诱导组HIF-1αmRNA相对表达量在培养1周时降低、2周时显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05);3周时两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。成软骨诱导组培养各时间点HIF-2αmRNA相对表达量均显著低于对照组,Sox-9 mRNA相对表达量均显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。培养过程中,Ⅱ型胶原及Ⅹ型胶原表达呈逐渐增加趋势,第2、3周时两者的mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。而成软骨诱导组多聚蛋白聚糖mRNA相对表达量在各时间点均高于对照组(P<0.05)。结论 HIF-1α参与诱导hBMSCs成软骨分化过程,但HIF-2α表达在该分化过程中受抑制。
- 龚铭黄胜罗嘉全黄保丁周治宇代学俊高蔓蔓李亮平邹学农
- 关键词：低氧诱导因子成软骨分化
- 氯化锰标记内皮祖细胞体外磁共振成像的实验研究
- 目的初步探讨使用氯化锰标记内皮祖细胞体外磁共振成像(MRI)的可行性,为活体内MR示踪观察内皮祖细胞归巢的特性奠定基础。方法密度梯度离心法分离获取骨髓来源的内皮祖细胞,用形态学观察、流式细胞仪细胞表面标志测定、荧光鉴定和...
- 庄文权范惠双唐欲博黄保丁彭新生邹学农邹学农
- 人骨形成蛋白7基因重组2型腺相关病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达被引量：4
- 2007年
- 目的构建人骨形成蛋白7基因(hBMP7)重组腺相关病毒载体,并观察其在兔骨髓间充质干细胞中的表达。方法将骨形成蛋白7基因片段克隆入穿梭质粒 pUC18获得重组质粒pUC18-hBMP7。Kpn Ⅰ和 Sa Ⅱ双酶切质粒 pUC18-hBMP7与 pSNAV,用 T4DNA 连接酶连接分别回收的两片段后转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞,获得重组质粒 PSNAV-hBMP7,转染 BHK-21细胞,筛选培养,用能表达 Rap 和 Cap 的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒 HSV1_(-rc)/ΔUL2感染此细胞,裂解细胞收获病毒液。采用氯仿处理-PEG/NaCl 沉淀-氯仿抽提法分离浓缩、纯化与测定病毒滴度。用 rAAV2-hBMP7和 rAAV2-EGFP 在体外分别转染兔骨髓间充质干细胞。流式细胞仪、RT-PCR 和 Western-blot 方法检测兔骨髓间充质干细胞中 hBMP-7基因的转录和表达。结果成功构建具有感染活性的重组腺相关病毒载体 rAAV2-hBMP7,病毒载体对兔骨髓间充质干细胞早期转染效率可达99.8%,hBMP7在兔骨髓间充质干细胞中可得到转录和表达。结论成功构建了人骨形成蛋白7基因重组腺相关病毒载体,rAAV2-hBMP7载体在体外可转染兔骨髓间充质干细胞,并获得较高的转染效率。
- 康焱廖威明盛璞义张珑涓原向伟雷磊黄保丁
- 关键词：骨髓祖代细胞中胚层人骨形成蛋白腺相关病毒
- IRAK-4基因沉默对人成骨样细胞凋亡的影响
- 2013年
- 【目的】研究siRNA沉默白细胞介素-1受体相关激酶-4(IRAK-4)基因对人成骨样细胞株MG63凋亡及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响。【方法】以Lipofectamine 2000为载体将IRAK-4-siRNA转染入MG63细胞(CON组:不加入任何转染试剂;SC组:以scrambled siRNA序列进行转染;KD组:以特异性IRAK-4-siRNA序列进行转染),应用流式细胞术及TUNEL法检测细胞凋亡水平,western blotting检测Bcl-2、Bax基因的表达。【结果】与对照组相比,靶基因沉默组(KD组)细胞的IRAK-4 mRNA及蛋白表达水平显著降低;转染48h后,KD组细胞增殖变缓,凋亡增加,Bcl-2蛋白的表达明显下调且Bcl-2/BaxSC>Bcl-2/BaxKD;Spearman等级相关分析显示MG63细胞凋亡比例与Bcl-2/Bax的比值间有显著的相关性。【结论】siRNA沉默IRAK-4基因能够诱导人成骨样细胞株MG63凋亡,且靶细胞凋亡水平与Bcl-2、Bax基因表达水平的比值相关。
- 杨子波傅明张紫机黄保丁张志奇廖威明
- 关键词：人成骨样细胞IRAK-4RNA干扰基因沉默
- 重组35型腺病毒介导人骨形成蛋白基因对脂肪源性干细胞的诱导分化被引量：3
- 2007年
- 目的在体外运用人骨形成蛋白7(human bone morphogenetic protein7,hBMP-7)基因重组35型腺病毒(recombinant adenovirus's containing fibers derived from B-group serotype35,rAd5/F35)诱导大鼠脂肪源性干细胞(adipose-derived adult stem cell,ADASC)向成骨细胞定向分化,为骨组织工程探索新的细胞来源。方法以pcDNA1.1/氨苄青霉素-hBMP-7质粒为模板扩增hBMP-7基因,将回收的PCR产物片段克隆入pDC316载体,获得重组质粒pDC316-hBMP-7。骨架质粒pBHG-fiber5/35和穿梭质粒pDC316-hBMP-7共转染293细胞,同源重组产生rAd5/F35-hBMP-7。同样的方法构建rAd5/F35-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)。在体外分别转染大鼠ADASC并留置空白对照。观察细胞形态和生长情况,ELISA检测转染基因的转录和表达,检测钙结节和骨钙素等成骨细胞表型。结果PCR、酶切鉴定表明rAd5/F35-hBMP-7质粒构建正确。rAd5/F35-EGFP对大鼠ADASC中转染效率可达90%以上,hBMP-7基因存在于转染后的ADASC中并表达相应的蛋白,诱导组钙结节形成,电镜见胞质中有钙质成分,碱性磷酸酶阳性,骨钙素表达增强。结论rAd5/F35介导hBMP-7基因可促进ADASC向成骨细胞定向分化。
- 康焱廖威明袁振华张珑涓原向伟雷磊黄保丁
- 关键词：腺病毒脂肪源性干细胞人骨形成蛋白基因治疗
- 白细胞介素1受体相关激酶4基因沉默抑制人成骨样细胞相关基因的表达被引量：1
- 2013年
- 背景:造成假体周围骨溶解的完整分子机制目前尚未完全清楚。假体周围骨溶解、吸收是人工关节松动的典型病理生理过程。白细胞介素1通过MAPK信号通路影响骨吸收进程。目的:实验通过观察siRNA沉默白细胞介素1受体相关激酶4(interleukin-1 receptor-associated kinase-4,IRAK-4)基因表达对人成骨样细胞株MG63的MAPK信号转导通路的影响,为防治人工关节置换后假体周围骨溶解提供实验基础。方法:以Lipofectamine 2000为载体将IRAK-4-siRNA转染入MG63细胞。实验分为3组,空白组不加入任何转染试剂;对照组以scrambled siRNA序列进行转染;沉默组以特异性IRAK-4-siRNA序列进行转染。Western blot检测靶细胞细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38MAPK基因的表达。结果与结论:与对照组相比,靶基因沉默组的IRAK-4 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。MG63细胞IRAK-4表达下调后,与空白组和对照组相比,c-Jun氨基末端激酶1/2P46、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2、磷酸化p38MAPK表达下调分别为62%,64%,68%(P<0.05)。结果证实,siRNA沉默IRAK-4基因抑制人成骨样细胞株MG63细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38MAPK基因的表达。
- 杨子波黄保丁向珊珊邬培慧张志奇廖威明
- 关键词：骨组织构建假体周围骨溶解无菌性松动人成骨样细胞基因沉默
- 腺相关病毒介导人骨形态发生蛋白7基因体外转染脂肪源性干细胞的研究被引量：4
- 2006年
- 目的构建人骨形态发生蛋白7(hBMP7)基因重组腺相关病毒载体并观察其在脂肪源性干细胞(ADAS cells)中的表达,为骨组织工程探索新的基因治疗方法和细胞来源。方法以pcDNA1．1／Amp-hBMP7质粒为模板扩增,将回收的PCR产物片段克隆入pUC18载体,获得重组质粒pUC18-hBMP7。双酶切质粒pUC18-hBMP7、pSNAV,回收的两片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV-hBMP7。用重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc／△UL2感染BHK-21细胞,裂解细胞收获病毒液。采用“氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提”三个步骤分离浓缩和纯化,测定病毒滴度。培养大鼠ADAS cells,并检测细胞表面标记物。在体外分别转染rAAV2-hBMP7和rAAV2-GFP,流式细胞仪、Western-blot方法检测转染基因的表达。结果PCR、酶切鉴定以及测序分析表明,BMP7基因成功克隆入质粒pSNAV-hBMP7载体中,并在BHK21细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7。早期对ADAS cells的转染效率可达90％, Western-Blot方法检测到第1周与第8周的转染组细胞均有蛋白水平的表达。结论成功构建了hBMP7基因重组腺相关病毒载体和培养出大鼠ADAS cells,rAAV2-hBMP7载体在体外可高效转染大鼠ADAS cells。
- 康焱廖威明盛璞义张珑涓原向伟雷磊黄保丁
- 关键词：腺相关病毒脂肪源性干细胞基因治疗
- siRNA抑制成骨样细胞IL-1受体通路IRAK-4表达
- 目的 利用RNA干扰(RNAi)技术抑制人成骨样细胞株白细胞介素-1受体相关激酶-4(interleukin-1 receptor-associated kinase 4,IRAK-4)的表达,了解IRAK-4基因在成骨...
- 杨子波黄保丁廖威明傅明何爱珊盛璞义康焱
- 活血化瘀中药单体对EPCs的作用与机理
- 内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞(endothelial cells，ECs)的前体细胞，是一群介于血液-血管细胞与成熟内皮细胞之间的具有较强增殖分化能力、可...
- 邹学农唐欲博黄保丁梁堂钊郭玮彭新生孙来保陈孝
- 关键词：内皮祖细胞中药单体腰椎间盘退变性疾病发病机理诱导分化
- 文献传递
- 骨质疏松症抑制人间充质干细胞的成骨分化被引量：4
- 2014年
- 【目的】为研究患者来源干细胞成骨分化的差异性,选取临床诊断为骨质疏松症患者的骨髓干细胞进行成骨分化诱导。【方法】采用密度梯度离心法,从临床6名患者(骨质疏松症3人,非骨质疏松症3人)的腰椎骨髓血液中分离获得原代骨髓间充质干细胞,并体外扩增至3-4代后进行实验。成骨诱导液的成分包括地塞米松(100 nmoL/L),二磷酸抗坏血酸(0.05 mmoL/L),β-甘油磷酸钠(10 mmoL/L)溶解于含有100 mL/L胎牛血清的低糖DMEM中。通过测定hMSC的增值与碱性磷酸酶(ALP)含量反应干细胞成骨分化活性。定量PCR检测Runx-2、ALP及成骨标志基因osteocalcin(OC)和osteonectin(ON)表达水平;通过矿化结节茜素红染色确认并定量检测钙离子浓度。【结果】比较两组干细胞增殖差异,骨质疏松组较非骨质疏松组降低,而ALP含量无显著差异。Q-PCR检测显示在第3、7天时,骨质疏松组Runx-2、ALP的mRNA表达水平均显著低于非骨质疏松组。骨质疏松组的成骨相关基因OC在3、7、14 d时mRNA表达水平均显著低于非骨质疏松组,而ON仅在第7天表达具有显著差异;矿化结节染色及钙离子定量检测显示,较之非骨质疏松组,骨质疏松组矿化结节染色浅,钙定量降低。【结论】使用成骨诱导干细胞分化方案(地塞米松、二磷酸抗坏血酸、β-甘油磷酸钠)结果提示骨质疏松症患者的干细胞成骨分化能力较非骨质疏松患者降低。因此,选取有骨质疏松症患者自身的骨髓间充质干细胞作为治疗的种子细胞可能并不适用于临床。
- 代学俊岑蔼儿张春梅龚铭周治宇黄保丁叶淦湖邹学农
- 关键词：骨质疏松症人骨髓间充质干细胞成骨分化
