汤丹
- 作品数：5 被引量：14H指数：3
- 供职机构：吉林大学畜牧兽医学院更多>>
- 发文基金：黑龙江省农垦总局科技攻关项目黑龙江省自然科学基金长春市科技计划项目更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- Brazzein基因的合成及pGAPZαA-Bra表达载体的构建被引量：1
- 2008年
- [目的]为Brazzein基因在酵母SMD1168中转化和表达奠定基础。[方法]利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)合成Brazzein基因,将其连接到pMD18-T载体上,构建克隆载体pMD18-T-Bra。分别用XhoI和XbaI限制内切酶对克隆质粒pMD18-T-Bra和酵母表达载体pGAPZαA进行酶切,并在T4DNA连接酶作用下,将回收的目的基因连接到pGAPZαA载体上,构建重组质粒pGAPZαA-Bra。[结果]通过PCR扩增获得了约188 bp的Brazzein类似物的编码序列,将其克隆到pMD18-T质粒,用XhoI和XbaI双酶切后,连接到pGAPZαA载体,成功构建了重组表达载体pGAPZαA-Bra。Brazzein基因其中各碱基未发生突变,整个表达载体阅读框正确无误。[结论]利用基因工程的方法生产Brazzein是可行的。
- 王长远张丽萍刘松财汤丹
- 关键词：BRAZZEIN克隆
- 甜味蛋白Brazzein在毕赤氏酵母中表达的初步研究被引量：6
- 2009年
- 目的:采用pGAPZαA为表达载体,SMD1168毕赤酵母为受体系统,构建分泌型的甜味蛋白Brazzein毕赤酵母重组菌。方法:按照毕赤酵母偏爱密码子设计Brazzein基因,共设计4对引物。在上、下游引物分别引入XbaI与XhoI酶切识别位点,采用SOE-PCR法合成Brazzein基因,构建克隆载体pUC57-Bra与酵母表达载体pGAPZαA-Bra。将重组质粒线性化,电转导入毕赤酵母(Pichia. pastoris SMD1168)中,用高浓度的抗生素Zeocin筛选高拷贝转化子。将重组菌株接种于YPD培养基诱导表达,进行SDS-PAGE分析。结果:成功构建了分泌型的Brazzein毕赤酵母重组菌。SDS-PAGE表明,目标蛋白的相对分子质量与理论值一致,在诱导72h后目的蛋白表达量达0.12g/L。对纯化后的蛋白进行生物活性测定,经鉴定具有一定的甜味,表达的Brazzein蛋白生物学活性良好。
- 王长远张丽萍刘松财汤丹
- 关键词：BRAZZEIN基因毕赤酵母
- 甜味蛋白Brazzein基因酵母表达系统的建立被引量：5
- 2010年
- 根据甜味蛋白Brazzein基因成熟区的氨基酸序列,结合毕赤酵母的密码子偏爱性以及Brazzein蛋白质结构的相关研究,对甜味蛋白Brazzein基因进行改造,使表达的目的蛋白中包含3个突变氨基酸(29Asp→Lys,31His→Ala,41Glu→Lys)。采用重叠PCR(SOE-PCR)合成目的基因并克隆到pMD18-T载体,经测序鉴定,序列正确的质粒用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切。将回收得到的目的基因连接到经同样双酶切处理的pGAPZαA载体上,经PCR、酶切和测序鉴定,证明已成功构建pGAPZαA-Bra真核表达载体。将构建好的重组载体pGAPZαA-Bra用AvrⅡ线性化,电转进入巴斯德毕赤酵母中。筛选ZeocinTM阳性克隆菌,进行蛋白表达,SDS-PAGE结果表明蛋白表达成功。
- 史勇张明军张英李莉汤丹刘松财
- 关键词：甜味蛋白BRAZZEIN基因巴斯德毕赤酵母
- 梅花鹿鹿茸细胞端粒酶活性及其mRNA表达的检测被引量：4
- 2011年
- [目的]研究鹿茸生长期端粒酶的表达,为揭示鹿茸生长发育的调控机制提供了新思路。[方法]在鹿茸快速生长阶段,采用改进的TRAP(端粒重复序列扩增技术)法检测鹿茸顶端增殖区的间充质层、前软骨层和软骨层细胞及下端成熟区的端粒酶活性。同时,采用RT-PCR的方法检测各组织细胞中端粒酶催化亚基(TERT)mRNA的表达水平。[结果]在顶端增生区各组织细胞中均检测到了不同程度的端粒酶活性,间质细胞、前软骨细胞和软骨细胞中的相对端粒酶活力分别为91.2、46.4和13.7,而在成熟区组织中则检测不到端粒酶活性。RT-PCR法检测的各组织细胞中TERTmRNA的表达水平与端粒酶活性检测结果一致。[结论]在鹿茸快速生长阶段,其增殖区表达端粒酶,并且端粒酶活性随组织层细胞的分化程度的增高而逐渐降低,说明端粒酶可能在鹿茸的生长过程中起重要的调控作用。
- 孙浩然郑伟吴山力王春艳郑梅竹汤丹朱乾琨张玉静
- 关键词：端粒酶TRAPRT-PCR
- 基于链替代扩增-纳米金比色直观检测单链核酸方法的研究
- 2011年
- [目的]将链替代扩增技术与核酸修饰纳米金积聚变色的光学特性相结合,设计了一种新型的直观检测3′端暴露单链核酸的方法,实现对单链核酸的高灵敏度检测。[方法]设计一条含有硫代修饰酶切位点的单链核酸（ZDNA）,其酶切位点5′端是能将核酸修饰纳米金变色的Linker序列,3′端是能与Target单链核酸3′端完全互补的H序列。当无Target存在时,Linker会充分暴露,能使核酸修饰纳米金积聚呈现紫色;但是当Target存在时,会与H序列完全互补,作为ZDNA的引物进入链替代扩增循环,形成的新链不断与Linker序列互补,不能使核酸修饰纳米金积聚呈现红色,从而间接检测了Target单链核酸。[结果]通过一系列试验确定检测体系,具体为：40μl修饰纳米金溶液（0.52 nmol/L）加入10μl酶循环体系（ZDNA20 nmol/L,33 mmol/L Tris-HCl（pH值7.9）;10 mmol/L MgCl2;66 mmol/LNaCl;0.5 mmol/LdNTP;0.1 mg/ml BSA;0.05 U/μl klenow;1 U/μl Hinc II）,直观或紫外检测并绘制Target浓度与纳米金积聚程度的标准曲线,表明Target浓度在1~200 pmol/L的范围内呈现良好的线性关系,R2=0.946,最低检测限是1 pmol/L。[结论]链替代扩增-纳米金比色检测单链核酸方法简便、直观、成本低,与传统修饰纳米金比色检测DNA方法相比,灵敏度提高了104倍。
- 朱乾琨汤丹孙浩然焦虎平张玉静
- 关键词：核酸检测
