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类弹性蛋白标签在大肠杆菌周质空间中表达研究被引量：2: 2016年; 旨在研究类弹性蛋白[I]_(40)(elastin-like polypeptide[I]_(40),ELP[I]_(40))在大肠杆菌周质空间的表达。构建表达载体pIG6LH/ELP[I]_(40)及pIG6LH/ELP[I]_(40)+Trx,分别将构建的表达载体转化入表达宿主菌E.coli BLR(DE3),IPTG诱导表达,采用可逆相变循环(Inverse transition cycling,ITC)技术纯化蛋白。测定ELP[I]_(40)及ELP[I]_(40)+Trx蛋白相变温度(T_t),检测ELP[I]_(40)、ELP[I]_(40)+Trx蛋白浓度及NaCl对相变温度的影响。结果显示,经3轮ITC纯化得到了ELP[I]_(40)、ELP[I]_(40)+Trx蛋白。分别测定ELP[I]_(40)和ELP[I]_(40)+Trx在10、25、50、75和100μmol/L浓度下的T_t,其T_t依次为31.5℃、29℃、27℃、26℃、25℃和31.8℃、29.5℃、27.5℃、26℃、25.5℃;测定了不同浓度的NaCl对T_t影响,在ELP[I]_(40)和ELP[I]_(40)+Trx终浓度为25μmol/L,NaCl浓度为0.25、0.5、0.75、1.00和1.25 mol/L时,分别使ELP[I]_(40)的T_t由29℃降至24.5℃、22℃、19℃、15℃和11.5℃,使ELP[I]_(40)+Trx的T_t由29.5℃降至25℃、23℃、20.2℃、15.5℃和11.8℃。在大肠杆菌周质空间表达的ELP[I]_(40)与胞内表达的具有相同的理化性质,ELP可作为在大肠杆菌周质空间表达的蛋白质分离纯化标签。; 李晶泉林衡丁宁左晓雪史晋萍徐永平冷春玲杨春光; 关键词：硫氧还蛋白大肠杆菌分离纯化

优化重组人C-反应蛋白在酵母中的分泌表达: 2013年; 目的：通过优化引导蛋白分泌的信号肽（signal peptide，SP），构建高效分泌表达具有免疫活性的重组人C-反应蛋白（recombinant human C-reactive protein，rhCRP）的毕赤酵母菌株。方法：通过重叠PCR和DNA重组技术，分别将信号肽MFαSP、CRNSP、SUC2SP和MFα-op SP的基因重组到rhCRP基因的5’端后克隆到毕赤酵母表达载体上．获得的4种重组质粒分别重组到毕赤酵母菌x．33中进行甲醇诱导分泌表达，Western blot法鉴定蛋白分泌情况;利用HisTrap HP柱纯化rhCRP后用间接ELISA法鉴定其免疫反应性。结果：成功构建了4种重组质粒。4种sP能引导表达出大小约为23kD的rhcRP，其中MFdSP引导rhCRP分泌的量约为另外3种信号肽的3-12倍。间接ELISA检测表明，纯化的rhCRP具有特异的免疫反应性。结论：成功筛选出了高效分泌表达rhCRP的重组毕赤酵母菌株并表达、纯化得到具有免疫反应性的rhCRP，为rhCRP相关的进一步临床及基础研究奠定了基础。; 李军明林衡葛高顺张立超胡学军; 关键词：C-反应蛋白毕赤酵母信号肽分泌表达

重组人C反应蛋白在甲醇酵母中的分泌表达及鉴定: 2013年; 目的构建重组人C反应蛋白(rhCRP)甲醇酵母分泌表达菌株,表达、纯化rhCRP并鉴定其免疫反应性。方法将人工设计合成的rhCRP基因克隆到甲醇酵母表达载体pPICZαA上,经SacⅠ线性化得到重组质粒pPICZαA/rhCRP后转化至甲醇酵母X-33中,利用甲醇诱导进行分泌表达,并用组氨酸标签进行亲和层析纯化rhCRP。采用SDS-PAGE、Western blotting检测表达、纯化的目的蛋白,通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定其免疫反应性和稳定性。结果成功构建人CRP的重组甲醇酵母表达载体pPICZαA/rhCRP,重组酵母菌株成功诱导分泌表达23×103的rhCRP;一步纯化即得纯度为90.42%的目的蛋白,间接ELISA法检测表明,纯化产物rhCRP具有特异的免疫反应性和一定的稳定性。结论利用甲醇酵母表达系统,成功获得了较高纯度的具有免疫反应性的rhCRP,为下一步制备抗人CRP抗体及自主研发人CRP检测试剂提供重要的实验基础。; 李军明林衡张立超葛高顺胡学军; 关键词：C反应蛋白质甲醇酵母分泌表达免疫反应性

聚乙二醇对ELP[I]_(40)相变温度的影响被引量：1: 2013年; 目的:研究聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)对类弹性蛋白(elastin-like protein,ELP)ELP[I]40相变温度(inverse temperature transition,Tt)的影响。方法:设计并合成ELP[I]40基因(由40个(VPGIG)五肽单元串联组成),表达纯化后,检测不同浓度PEG条件下ELP[I]40的Tt。结果:在ELP[I]40终浓度为25μmol/L时,PEG浓度为5%,10%,15%,20%,25%时分别使Tt由29℃降至26.5℃,22℃,15.2℃,8.8℃,2.5℃。结论:PEG可降低ELP的Tt,可通过PEG促进ELP重组蛋白分离纯化。; 林衡李军明葛高顺张立超孙利慧胡学军; 关键词：聚乙二醇相变温度分离纯化

组成型表达重组人C-反应蛋白的毕赤酵母菌株构建被引量：1: 2013年; 目的:构建组成型表达重组人C-反应蛋白(Recombinant human C-reactive protein,rhCRP)的毕赤酵母工程菌株,表达、纯化rhCRP并鉴定其免疫反应性。方法:将设计合成的rhCRP基因克隆到表达载体pGAPZαA上并转化至毕赤酵母X-33中进行组成型分泌表达,通过His亲和层析柱纯化rhCRP。分别采用SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA法检测目的蛋白并鉴定其免疫反应性。结果:重组表达载体pGAPZαA/rhCRP经酶切及DNA测序鉴定构建成功。重组毕赤酵母工程菌株成功组成型表达23kDa的rhCRP,27h即达到最大表达水平,表达量约3mg/L。经一步分离纯化获得纯度为96.58%的rhCRP,经间接ELISA检测表明其具有免疫反应性。结论:成功构建了组成型分泌表达rhCRP的毕赤酵母菌株,为进一步自主研发人CRP检测试剂奠定了基础。; 李军明林衡葛高顺张立超于昉胡学军; 关键词：C-反应蛋白毕赤酵母组成型表达免疫反应性

类弹性蛋白标签在重组蛋白分离纯化中的应用被引量：4: 2012年; 类弹性蛋白(elastin-like polypeptide,ELP)是一种非常有前途的重组蛋白分离纯化标签。这种人工合成的蛋白质多肽是由五肽重复序列单元(VPGXG)串联组成,具有温度诱导的可逆相变特性。ELP与目的蛋白融合后,赋予重组蛋白相类似的可逆相变性质。多次可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)之后,就可以从蛋白溶液混合液中选择性地分离出ELP融合蛋白,再经特异性酶切或者改变环境条件引发内含肽发生自我剪切去除ELP标签,从而得到单一的目的蛋白,实现简单快速分离纯化重组蛋白。目前,该技术已成功应用于原核大肠杆菌和植物表达系统中。大肠杆菌表达ELP-绿色荧光融合蛋白的最高产量可达1.6g/L。这种非色谱分离纯化重组蛋白的方法具有技术简单、操作快速、成本低、易于扩大等优点。重点从该技术的原理、技术路线以及发展方向进行综述。; 林衡许崇波孙利慧胡学军; 关键词：可逆相变重组蛋白分离纯化

疏水性ELP基因设计与基因库构建被引量：4: 2013年; 【目的】设计合成疏水性类弹性蛋白(Elastin-like polypeptide,ELP)基因,建立ELP基因库。【方法】选择疏水性最强的异亮氨酸(Ile,I)(疏水参数:4.5)取代ELP五肽重复序列单元(缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-客座氨基酸-甘氨酸,VPGXG)中客座残基X。全基因合成一段含编码(VPGIG)10序列,上游含DraⅢ酶切位点、下游含BglⅠ酶切位点的ELP单元。将DraⅢ和BglⅠ设计为一对同尾酶(Isocaudarner),利用这对同尾酶定向克隆(Recursive directional ligation,RDL)一系列不同拷贝数的ELP基因。为鉴定基因库有效性,随机选取库中ELP[I]50基因进行蛋白表达、纯化并测定其相变温度(Inverse temperaturetransition,Tt)。【结果】建立了ELP[I]n(n=10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120)基因库。测定ELP[I]50的Tt为24.3°C。【结论】首次单独选用Ile(I)作为ELP蛋白质标签中客座残基氨基酸,增加了ELP中疏水性氨基酸的含量,为进一步筛选出表达量高、Tt低、分子量小的ELP标签奠定基础。; 林衡李军明张立超葛高顺许崇波胡学军; 关键词：异亮氨酸同尾酶定向克隆

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