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弓形虫P30基因-乳酸乳球菌重组质粒的构建及其表达被引量：5: 2012年; 目的构建表达弓形虫昆山分离株P30基因的乳酸乳球菌表达载体L2-Ps-P30-T,并在乳酸乳球菌中表达P30蛋白。方法用BamHⅠ/XhoⅠ将P30从质粒pSK-P30中切出并克隆至质粒pSK-PsT,构建pSK-Ps-P30-T质粒;用PvuⅡ将表达元件-Ps-P30-T-从pSK-Ps-P30-T质粒中切出,以相同的酶切位点导入大肠埃希菌与乳酸乳球菌穿梭质粒pTRKL2,构建L2-Ps-P30-T质粒;通过电转化将L2-Ps-P30-T导入乳酸乳球菌中,以Western blot鉴定P30蛋白的表达。结果酶切及PCR鉴定质粒L2-Ps-P30-T构建正确,并在乳酸乳球菌中表达能被弓形虫病患者血清识别的分子质量单位为30ku的蛋白。结论重组载体L2-Ps-P30-T构建正确,电转化入乳酸乳球菌后能表达具有反应原性的P30蛋白。; 易艳军许丽芳周支香杨秋林; 关键词：弓形虫 P30 乳酸乳球菌

应用环介导等温扩增技术检测弓形虫被引量：25: 2008年; 目的用环介导等温扩增(LAMP)技术检测弓形虫。方法用酚-氯仿法提取弓形虫速殖子基因组DNA,设计两对扩增弓形虫B1基因的LAMP引物。以间日疟原虫、恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、日本血吸虫及小鼠白细胞作对照,进行LAMP反应,产物经SYBRGreenI显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性。将弓形虫速殖子经倍比稀释为(2～3)×106个/ml至(2～3)×10-1个/ml等8个浓度,进行LAMP反应,验证该方法的敏感性。结果LAMP反应结果显示,弓形虫速殖子检测管经显色后呈绿色,对照组均呈棕色。弓形虫的LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组均无扩增产物。LAMP技术可检测到的弓形虫速殖子最低浓度为2～3个/ml。结论LAMP技术在弓形虫检测中显示出较好的特异性与敏感性。; 杨秋林张如胜伍和平张愉快王可耕; 关键词：弓形虫环介导等温扩增技术

四种纯化弓形虫速殖子方法对虫体RNA影响的比较被引量：7: 2006年; 目的比较纯化弓形虫速殖子的四种方法对虫体RNA的影响。方法以2.0×105个速殖子腹腔接种于昆明小鼠,72h后收集小鼠腹腔液,以胰蛋白酶消化法、微孔滤膜过滤法、G3滤斗和CF-11纤维素柱法纯化弓形虫速殖子,用AGPC法抽提总RNA,用甲醛变性胶电泳检测总RNA。结果胰蛋白酶消化法虫体回收率最大,但时间长,易造成RNA降解;微孔滤膜过滤法回收率低;G3滤斗纯度不高;CF-11纤维素柱法快速简单、纯度高,对RNA无影响。结论微孔滤膜过滤法、CF-11纤维素柱法对虫体RNA的影响小,较适用于cDNA文库构建时虫体的分离纯化。; 杨秋林许丽芳伍和平; 关键词：弓形虫病

SjESG-2A锤头状核酶表达载体构建及其抗日本血吸虫虫卵发育研究: 2008年; 目的设计并合成日本血吸虫中国大陆株卵壳蛋白基因2A(eggshell protein gene 2A,ESG-2A)的特异性锤头状核酶并构建真核表达载体。探讨其在BALB/c小鼠体内的抗日本血吸虫虫卵发育作用。方法运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ),将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,采用双酶切、琼脂糖凝胶电泳及DNA序列测定方法鉴定阳性克隆。以日本血吸虫尾蚴感染BALB/c小鼠,建立动物模型。大量抽提阳性重组子,分别在小鼠感染时、感染后2w、感染后4w,将其经后腿胫前肌免疫BALB/c小鼠,共3次。小鼠感染6w后计数成虫负荷及肝组织虫卵数。ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清IFN-γ和IL-4的水平。结果经酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA3.1(+)的XbaI和EcoR I酶切位点之间,命名为pcRz-ESG-2A。在核酶组,IFN-γ的水平呈上升趋势,IL-4的水平呈先上升后下降;在空载体组和生理盐水组,IFN-γ的水平呈上升趋势,IL-4的水平也呈上升趋势。核酶组免疫BALB/c小鼠能诱生减虫率25.64%和减卵率44.21%。结论成功合成SjESG-2A特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体。核酶在已感染日本血吸虫尾蚴的BALB/c小鼠体内具有抗日本血吸虫虫卵发育的作用。; 胡永轩周月兰肖建华杨秋林黄家芳; 关键词：锤头状核酶

日本血吸虫7个基因全长cDNA的获取和分析被引量：1: 2004年; 目的　从日本血吸虫成虫cDNA文库中分离、鉴定和分析全长cDNA序列 ,为日本血吸虫病的防治提供候选疫苗和药物靶点。方法　从构建日本血吸虫成虫cDNA文库中挑取重组阳性克隆进行 5’测序获取表达序列标签 (ExpressedSe quenceTag ,EST) ,在此基础上进行引物延伸法 (primerextension)测序 ,直至获取全长cDNA序列 ,将获取的基因登录Gen Bank ,并进行生物信息学分析。结果　获得 7个日本血吸虫全长cDNA序列 (GenBank登录号分别为AY336 4 93～AY336 4 99) ,其中 6个为日本血吸虫新基因 :类转录因子BTF3(similartotranscriptionfactorBTF3)、延长因子 1-α(elongationfactor 1-alpha ,EF1-α)、富含谷氨酰胺四联重复肽 (smallglutamine-richtetratricopeptide ,TRP)、鸟氨酸氨基转移酶 (ornithineaminotransferase,OA)、内皮差异相关因子 1(endothelialdifferentiation -relatedfactor 1,EDF - 1)和类基因转录增强因子 (similartotestisenhancedgenetranscriptprotein ,TEGT) ;另 1个是精氨酸酶 (arginase)基因 ,比原发现的基因序列长 4 5 6bp。生物信息学分析发现类基因转录增强因子为跨膜蛋白 ,具有 6个跨膜区 ;各基因与人、鼠、蟾和曼氏血吸虫等物种的基因有 37%～ 85 %的同源性 ;; 曾桥肖建华万志刚张愉快廖力刘传爱杨秋林; 关键词：日本血吸虫 CDNA文库基因生物信息学

弓形虫昆山分离株P30蛋白的纯化、复性和鉴定被引量：3: 2008年; 目的表达并纯化弓形虫昆山分离株膜蛋白P30。方法将构建的pET28b-P30重组质粒转入大肠埃希菌BL21,挑重组菌于LB培养基中增菌,IPTG诱导其表达,然后纯化包涵体,用尿素溶解包涵体,Ni2+螯合柱纯化产物,以透析法复性蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果大肠埃希菌表达的P30蛋白以包涵体的形式存在,P30蛋白经Ni2+螯合柱纯化后纯度大于95%。经Western blot鉴定,复性蛋白能被弓形虫感染的鼠血清识别。结论得到了纯度高的膜蛋白P30。; 周月兰蔡亮王际平肖建华杨秋林; 关键词：P30 纯化复性

日本血吸虫SjBT基因的获得与生物信息学分析被引量：4: 2004年; 目的　从日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新基因 ,为防治日本血吸虫病提供药物靶标或候选疫苗。　方法　构建日本血吸虫成虫cDNA文库 ,用序列标签法随机挑取重组阳性克隆进行测序 ,对部分序列进行步移法测序获取其全长cDNA ,并进行生物信息学分析和登录。　结果　获得了 1个日本血吸虫新基因 ,全长 14 3 9bp ,编码 44 3个氨基酸 ,与肝片形吸虫微管蛋白基因具有 79%的同源性。编码蛋白的理论分子质量为 7.2 198ku ,等电点为 9.12 ;抗原表位可能位于cDNA序列 3 73～ 3 96处。　结论　表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术有利于发现日本血吸虫新基因。; 廖力肖建华王可耕曾桥梁瑜杨秋林; 关键词：微管蛋白生物信息学表达序列标签

日本血吸虫成虫cDNA表达文库的构建及鉴定被引量：8: 2002年; 目的　通过构建日本血吸虫成虫 c DNA表达文库 ,免疫筛选全长目的基因 ,研究其结构和功能。　方法　采用 TRIZOL试剂提取日本血吸虫成虫总 RNA,Oligotex m RNA Midi Kit分离 m RNA,并用 Stratagene的建库试剂盒构建日本血吸虫 c DNA表达文库。　结果　构建的日本血吸虫成虫 c DNA表达文库容量为 2× 10 6 pfu/ ml,扩增后文库的滴度为 1.4× 10 7pfu/ ml。文库的重组率达到 96%以上 ,插入片段平均长度为 1.4kb。; 杨胜肖建华张愉快曾桥杨秋林刘传爱王可耕应康唐蓉; 关键词：日本血吸虫 CDNA 文库

日本血吸虫pcDNA3.1(-)/Sj20.8真核表达及其对小鼠保护性免疫作用被引量：1: 2006年; 为检测日本血吸虫新基因Sj20.8作为核酸疫苗能否诱导小鼠产生保护性免疫作用,用PCR法扩增Sj20.8基因序列,构建重组质粒pcDNA3.1(-)/Sj20.8,肌肉注射免疫小鼠后检测发现,Sj20.8能在小鼠肌肉中短时间存在并有微弱表达,但未能诱导小鼠产生一定水平的保护性免疫。; 曾桥肖建华万志刚廖力张愉快刘传爱杨秋林; 关键词：日本血吸虫 CDNA文库

米索前列醇用于钳夹术前50例观察: 2004年; 目的　观查米索前列醇用于钳夹术前的临床效果。方法　实验组术前 3h宫颈置米索前列醇粉末 40 0 μg ,对照组用 1 6号导尿管于术前 1 2h机械扩张宫颈。结果　实验组无阻力扩宫明显增加 ,手术时间明显缩短 ,术中并发症明显减少。结论　实验组在宫颈软化、宫口扩张、减轻病人痛苦和减少并发症的发生等方面明显优于对照组 ,且操作简便 ,有效的提高了手术质量。; 许丽芳杨秋林李丰月; 关键词：米索前列醇钳夹术宫颈软化宫口扩张

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杨秋林

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