张拓
- 作品数：14 被引量：28H指数：3
- 供职机构：北京蛋白质组研究中心更多>>
- 发文基金：中国烟草总公司科技项目贵州省科技厅农业攻关项目北京市留学人员科技活动择优资助项目更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学理学更多>>
- 溶菌酶活性测定方法的改进及其在重组人溶菌酶质量标准建立中的应用
- 2014年
- 获得一种趋于均相反应体系的比浊法,用于重组人溶菌酶活性的研究,并建立相关操作规程和质量标准.通过显微计数法进行底物菌液质控,改进酶与菌液的混合方式和最佳酶用量,采用“双直线法”优化反应计时区间,并精确测定重组人溶菌酶含量.显微镜菌体计数法确定0.3 mg/mL底物菌液中菌体数保持在1.1 ×108个/mL左右;酶与菌液在样品池内经吸排法快速混合可趋近均相体系;酶的最佳用量为3μg;确定反应计时区间为0～60s;依据所制定的酶活性操作规程,确定重组人溶菌酶活性质量标准为45 000～ 65 000U/mg,日内、日间相对标准偏差均小于5％;优选Lowry法并精确测定蛋白含量为（1.0±0.1）mg/mL.改进后的方法稳定性得到明显提高,且操作简便、结果可靠,已被3家研究单位、企业验证并接受.建立的重组人溶菌酶活性和含量测定质量标准及操作规程具有实际参考价值.
- 宋纯艳张拓侯利平原剑黄亚娟韩治国刘曙晨甄蓓魏开华
- 关键词：比浊法
- 基质辅助激光解析电离质谱和电喷雾质谱共同快速确证达托霉素结构
- 2015年
- 运用基质辅助激光解析电离-飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF MS)和电喷雾-四级杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF MS)快速确证环脂肽达托霉素的结构。首先,ESI检测达托霉素相对分子量为1619.7107,与理论值偏差0.0007。选择其双电荷峰m/z 809.848作为母离子进行ESI串联质谱(MS/MS)测定,成功匹配了达托霉素环外氨基酸序列C9H19CO-Trp-Asn-Asp。其次,优化Li OH裂解达托霉素的实验条件,以MALDITOF/TOF MS监测开环效果,获得95%以上的开环样本后,分别运用MALDI和ESI进行MS/MS测定,达托霉素开环产物的b+和y+全部被匹配,达托霉素全部氨基酸序列得到确证。最后,对开环产物的ESI-MS/MS条件进一步优化,获得了丰富的低端碎片离子,解析了脂肪酸链结构,并绘制了脂肪酸链的裂解图。本方法快速、简便、准确,是确证环脂肽类化合物结构的可靠方法。
- 黄亚娟张拓韩治国孟晓光宋纯艳刘曙晨郑俊杰魏开华
- 关键词：达托霉素串联质谱电喷雾质谱
- 酶切质谱法和氰基化裂解法联合解析新药重组人门冬胰岛素二硫键被引量：3
- 2013年
- 目的:建立一种简化、快速、准确的分析含有相邻Cys的双链型二硫键的方法,并确定重组人门冬胰岛素的二硫键。方法:(1)ESI-Q-TOF质谱准确测定样品还原烷基化及烷基化前后的相对分子质量,计算二硫键数和自由巯基数;(2)采集Glu-C酶切肽质量指纹谱,MS-Bridge检索并确定1对链间二硫键;(3)简化氰基化裂解法步骤,LC-MS/MS测定关键肽段序列,自编软件结合人工解析,确定第2、3对二硫键。结果:(1)相对分子质量测定出重组人门冬胰岛素含3对二硫键;(2)酶切肽谱的序列覆盖率为100%,关键肽段m/z 1377.5568、m/z 2493.1045,测量偏差小于0.05,对应二硫键A20-B19。(3)Glu-C酶切液经氰基衍生后以ZipTip除盐代替HPLC制备,氨水裂解后用MALDI-TOF测肽谱,获得关键肽段m/z1530.7163,对应二硫键A6-A11,其串联质谱共匹配14个关键序列离子,碎片离子强度高,质量偏差小于0.01,证实该二硫键连接正确。结论:新药重组人门冬胰岛素主要的二硫键连接方式为A6-A11、A7-B7、A20-B19,与已知胰岛素一致。本方法降低了双链连接型胰岛素二硫键分析复杂度,简化了步骤,具有良好的实用性。
- 黄亚娟傅海媛侯利平孙云波张拓王东茂郑俊杰魏开华
- 关键词：肽质量指纹图谱质谱分析
- GASA基因超家族新成员——烟草抗菌肽基因的克隆及序列分析被引量：3
- 2012年
- 抗菌肽可以增强植物对病原微生物的抵抗能力,本研究利用生物信息学方法,获得了烟草品种K326的3种抗菌肽cDNA序列(NtSN1a、NtSN1b和NtSN2a),并对其进行了序列分析。结果表明,3种抗菌肽cDNA序列均具有完整的开放读码框,NtSN1a和NtSN1b均编码88个氨基酸,NtSN2a编码104个氨基酸。对推导的氨基酸序列分析发现,它们都具有典型的GASA基因超家族保守结构域,属于GASA基因超家族成员。系统进化分析表明,NtSN1a和NtSN1b与马铃薯抗菌肽snaking-1聚为一类,NtSN2a与马铃薯抗菌肽snaking-2聚为一类。这些结果为进一步研究抗菌肽基因的抑菌效应,比较其在烟草抗病防御反应中的作用奠定了基础。
- 林世锋任学良王东茂张拓王仁刚
- 关键词：烟草抗菌肽
- 大鼠脉络丛组织中锰毒性差异蛋白的筛选、鉴定和GO分析被引量：5
- 2011年
- 目的应用光镜、透射电镜及差异蛋白质组学技术探讨锰对构成血-脑脊液屏障的脑脉络丛组织(choroidplexus,CP)的病理损伤作用及其差异表达蛋白,并对这些差异蛋白按其gene ontology(GO)注释进行细胞学组分、分子功能与生物学过程的分类分析。方法采用雄性SD大鼠(1.5月龄)进行腹腔注射无水氯化锰(6 mg Mn/kg B.W)建立3个病程(30、90 d及90 d后无处理观察30 d)的锰中毒动物模型,分离其双侧侧脑室CP后,应用光镜与透射电镜观察锰所引起的CP病理形态学改变,同时应用蛋白质组学技术筛检出锰毒性相关的差异表达蛋白。结果病理形态学观察发现锰可引起CP上皮细胞发生不规则萎缩变小,微绒毛结构紊乱、缩短,胞浆内出现空泡,核质凝聚,线粒体结构破坏,细胞之间的紧密连接出现部分断裂或消失等,并且这些改变随病程发展表现为加重的趋势;2D-PAGE结合nano-LC-MS/MS的方法鉴定到了32个锰病程相关的差异蛋白质,其中有27个上调蛋白,5个下调蛋白。GO分类分析后发现差异表达蛋白主要分布在线粒体、膜表面以及细胞质内,以结合、催化活性以及转运功能为主,参与代谢与转运等生物学过程。结论锰可引起CP的细胞及亚细胞结构发生病理性损伤并表现为一定的时效性,即便停止锰染毒上述损伤仍然进行性加重;同时,还可造成CP中特定功能蛋白质随病程进展发生上调或下调的变化,这些改变很可能是锰引起BCB结构损伤和功能失调的分子基础,其功能蛋白质组学的研究值得进一步深入开展。
- 敬海明杨帆刘建中高文晖张拓赵超英马玲郑珊聂燕敏杜宏举张馨月原剑潘晨松蒲海李静魏开华李国君
- 关键词：脉络丛血-脑脊液屏障锰差异表达蛋白
- Label free方法研究大鼠脑脊液中锰毒性相关的差异蛋白质组
- 目的： 锰是人体必需微量元素,但过量的环境和职业锰暴露能够引起机体发生类帕金森氏综合征等神经退行性损伤为主的病理改变。目前发病机制尚不明了。本研究旨在探查临床可介入性生物样本脑脊液中锰毒性相关的差异表达蛋白谱,为今后深入...
- 敬海明张拓杨帆刘君丽董一文赵超英马玲张馨月刘建中张鹏蔡丽郑珊杜宏举聂燕敏李煜高珊李红张思玉巩文丰魏开华李国君
- 关键词：脑脊液毒性机制差异表达蛋白
- 烟草肌醇半乳糖苷合成酶基因NtGolS1的克隆及序列分析被引量：3
- 2012年
- 为从烟草中克隆到与植物抗逆相关的肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS,以辣椒GolS基因为探针,通过电子克隆法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码GolS基因的cDNA序列,暂被命名为NtGolS1。NtGolS1包含一个完整的开放读码框,编码343个氨基酸,具备糖基转移酶保守结构域;序列比对结果表明,NtGolS1蛋白与其他植物的GolS蛋白具有很高的相似性;系统进化树分析表明,NtGolS1与耐旱植物维柯萨的Gols亲缘关系最近。这些结果为进一步研究NtGolS1的性质和功能,并为植物抗逆基因工程研究提供理论基础。
- 林世锋王仁刚任学良王东茂张拓黄亚娟
- 关键词：烟草克隆
- MALDI-TOF/TOF和LC-MS/MS液质联用分析大鼠脑脉络丛的多肽组被引量：5
- 2010年
- 脉络丛(choroid plexus,CP)位于血液与脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)之间,不仅是CSF的重要来源,而且是构成血液-脑脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier,BCB)的组织基础.CP参与脑组织中一些血源性多肽的输送以及自身多肽合成的生理过程,在维持脑微环境动态平衡和调节中枢神经系统的正常功能方面起到非常重要的作用.本研究分别运用MALDI-TOF/TOF和LC-MS/MS液质联用系统分析了成年SD大鼠血液-脑脊液屏障(即脉络丛组织)中的多肽组.共鉴定到163个多肽(P<0.001),这些多肽为69种蛋白质的降解肽段,其中ATP合酶(ATP synthase),细胞色素c(cytochrome c),血红蛋白(hemoglobin),NADH-辅酶Q氧化还原酶(NADH-ubiquinone oxidoreductase),β珠蛋白(beta-globin)这5种蛋白质的肽段数占总肽段数的50%以上,并且部分多肽序列相似度高,类似其前体蛋白的逐步降解片段,而这些前体蛋白质的分子量多数在10kD至20kD之间.上述研究结果为SD大鼠脉络丛组织的生理功能研究及组织多肽组学的研究方法提供了有价值的科学资料.
- 杨帆敬海明张拓原剑赵超英马玲甄蓓李国君魏开华
- 关键词：生物质谱脉络丛
- 胃腺癌患者粪便蛋白质的提取及初步质谱分析被引量：1
- 2015年
- 目的：建立一个良好的粪便蛋白质提取、分析和鉴定的方法，为进一步探索消化系统疾病无创性诊治靶标提供新思路和奠定良好研究体系。方法采用生理盐水、Tris-HCl 和尿素缓冲液三种粪便蛋白质提取体系，处理健康人群、慢性萎缩性胃炎、胃腺癌术前、胃腺癌术后的粪便标本，通过 SDS-PAGE 进行比较，获得较好的粪便蛋白质提取方法。再利用液相串联质谱（1D LC-MS／MS）对提取的蛋白质进行初步分析。结果生理盐水和 Tris-HCl 缓冲液提取粪便蛋白质的效率明显较尿素法高，损失少，是粪便蛋白质比较有效和合理的提取方法。不同人群来源的粪便中均含有丰富的蛋白质，正常人、胃腺癌手术前及术后鉴定到的蛋白质达一百多种，在组成和含量上个体差异明显。疾病与正常间、疾病治疗前后，粪便蛋白质指纹图谱变化大。胃腺癌术前粪便中含有大量的免疫球蛋白和角蛋白，同时也鉴定到了α1-抗胰蛋白酶，但在其术后和健康者粪便中未见到这一现象。结论正常与胃癌、胃癌手术前与术后粪便蛋白质不仅有蛋白质种类的差异，而且相同蛋白质量的差异也相当明显。因此，利用蛋白质组学技术筛选人粪便中胃癌相关的蛋白质标志物有较强的可行性，但在未来的研究中需要差异分析结合定量质谱的方法进行。
- 傅淑宏魏开华李晓霞张拓龚美亮周玉李燕燕白洁
- 关键词：粪便蛋白质胃腺癌质谱
- 烟草根系蛋白质双向电泳样品制备方法的比较被引量：6
- 2012年
- 为探索适于烟草根系蛋白质组学研究的样品制备方法,以栽培品种K326生长期根系为材料,比较了常规裂解液法、TCA/丙酮沉淀法、Trizol抽提法和酚法等4种总蛋白质的提取方法。对制备的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及双向电泳(2-DE)检测。结果表明:酚法最佳,所获蛋白在单向SDS-PAGE中形成条带数目多而清晰;经双向电泳分离用银染显色,可检测约548个蛋白点,图谱分辨率较好,蛋白点清晰,主要集中在等电点pH5～8、相对分子量25.0～70.0kD,可有效解析烟草根系的蛋白质组。
- 林世锋张拓史跃伟王东茂王志红杨志晓谢升东魏开华任学良
- 关键词：烟草根系蛋白质蛋白质组蛋白提取双向电泳
