张志红
- 作品数：3 被引量：1H指数：1
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- NDPK-A及Cys突变体对A549细胞凋亡和氧化还原对其磷酸转移酶活性的影响
- 目的：对人二磷酸核苷激酶A亚基（NDPK-A）及其四种氧化还原异构体表达纯化，在自然及化学氧化还原环境中，研究NDPK-A及四种Cys突变体的磷酸转移酶活性。构建真核重组载体pEGFP-nm23-H1C145S、pEGF...
- 张志红
- 关键词：细胞凋亡
- 文献传递
- NDPK-A C4/109/145S突变体降低磷酸转移酶活性但增加DNase活性
- 2011年
- 核苷二磷酸激酶A(nucleoside diphosphate kinase A,NDPK-A)有广泛的生物学活性,在肿瘤转移和调控中起重要作用.单独抑制NDPK-A中任何1个Cys所形成的二硫键,不会降低NDPK-A的磷酸转移酶活性和DNase活性.本实验通过构建C4/109/145S突变体并研究其生物学效应,为NDPK-A结构与功能的研究提供参考.用定点突变法将NDPK-A的4位、109位和145位Cys突变为Ser,构建pBV220-NDPK-A C4/109/145S和pEGFP-NDPK-A C4/109/145S两种重组质粒.在大肠杆菌中高效表达NDPK-A C4/109/145S突变体,纯化后可获得均一的重组NDPK-A C4/109/145S突变体蛋白.HPLC法和DNA消化法测定发现,C4/109/145S突变体磷酸转移酶活性低于野生型NDPK-A,而DNase活性高于野生型NDPK-A.以A549细胞作为模式细胞的流式细胞仪周期检测表明,C4/109/145S突变体与野生型NDPK-A一致,均可将细胞周期延滞在S期和G2/M期.这些结果证实,NDPK-A结构异构与其磷酸转移酶活性密切相关,其酶活性至少需要1个Cys残基存在,NDPK-A结构中的二硫键也可能是其DNase活性的负调控机制之一,胞内NDPK-A的氧化还原异构可能对细胞周期无显著影响.
- 高雪张志红吕芬钱垂文王一飞熊盛
- 关键词：定点突变细胞周期
- 氧化还原对NDPK-A及突变体磷酸转移酶活性的影响
- 2012年
- 对核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)及其4种半胱氨酸突变体进行诱导表达及纯化,测定它们在氧化还原条件及正常条件下的磷酸转移酶活性,研究氧化还原及二硫键异构对NDPK-A及突变体活性的影响。将实验室之前构建成功的野生型NDPK-A(PBV-NDPK-A)及4种突变型NDPK-A基因(PBV-NDPK-A C4S,PBV-NDPK-A C109S,PBV-NDPK-A C145S,PBV-NDPK-A C4/109/145S)在大肠杆菌中高效表达;以DEAE-sepharose Fast Flow离子交换层析与Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B亲和层析技术纯化目的蛋白;HPLC法测定比较野生型NDPK-A及突变体在氧化还原和正常环境下磷酸转移酶活性。结果显示,NDPK-A及突变体在大肠杆菌中高效表达;经纯化分别获得了均一的NDPK-A蛋白及突变体蛋白,纯度均达到98%;在还原环境下NDPK-A及突变体的磷酸转移酶活性均高于正常环境下的活性,但是在氧化环境下的磷酸转移酶活性明显低于正常环境下。氧化还原环境对NDPK-A结构异构及磷酸转移酶活性有一定的影响,提示氧化还原环境可能调控NDPK-A二硫键的形成,影响蛋白的聚集状态,从而影响蛋白的磷酸转移酶活性,并且NDPK-A结构中可能有更为复杂的氧化还原调控酶活性机制。
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