秦欢欢
- 作品数:5 被引量:5H指数:1
- 供职机构:上海交通大学医学院附属瑞金医院更多>>
- 相关领域:医药卫生更多>>
- FⅧ A1亚基His99Arg突变导致FⅧ超不稳定性及一期法和二期法检测FⅧ活性不一致的研究
- 目的探讨FⅧHis99Arg突变患者FⅧ蛋白不稳定的分子机制并解释患者一期法和二期法FⅧ活性(FⅧ:C)检测结果不一致的原因。方法凝血功能筛查进行血友病表型的检测。一期法及二期法检测患者血浆FⅧ:C;将患者血浆在不同温度...
- 游国岭秦欢欢王学锋丁秋兰奚晓东王鸿利
- 三个遗传性血管性血友病家系表型诊断和基因型研究被引量:4
- 2011年
- 目的对3个遗传性血管性血友病(vWD)家系进行表型诊断和基冈型分析,探讨其分子发病机制。方法分别采用出血时间(BT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、瑞斯托霉素诱导的血小板凝集试验(RIPA)、血管性血友病因子(vWF)瑞斯托霉素辅因子(vWF:RCo)、vWF抗原(vWF:锥)、vWF活性(vWF:A)测定,vWF胶原结合试验(vWF:CB),vWF与FⅧ结合试验(vWF:FⅧ:B)和多聚体分析对3例vWD先证者和家系成员进行表型诊断。提取3例先证者外周血基因组DNA,用PCR法扩增vWF基因的52个外显子及侧翼序列,通过直接测序分析vWF基因变异。结果3例先证者Am均延长,BT除先证苦3外均正常,血浆R1PA、vWF:RCo、vWF:Ag、vWF:A和vWF:CB均有不同程度的减低。多聚体分析结果显示先证者3中、高分子质量多聚体缺失,而先证者1、2基本正常。对3例先证者进千亍基冈测序,共发现3个杂合突变,分别为vWF基因的C144067A(112287Q)、GI10374A(R1374H)、CI10770T(S1506I,)以及28号外显子G110667A(D1472H)杂合多态性。结论R2287Q、R1374H和S15061.这3种杂合错义突变及D1472H杂合多态性足分别导致3例先证者发生遗传性vWD的分子发病机制。其中R2287Q是国际首次报道的新突变.
- 秦欢欢王学锋丁秋兰许冠群张利伟戴菁陆晔玲奚晓东王鸿利
- 关键词:血管性血友病因子血管性血友病DNA突变分析
- His99Arg突变患者血浆凝血因子Ⅷ活性的稳定性研究
- 2013年
- 目的探讨His99Arg突变致患者血浆凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性检测结果变化大及一期法和二期法FⅧ活性检测结果不相符的分子发病机制。方法以凝固法检测先证者及家系成员凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT),FⅧ活性(FⅧ∶C)、FⅨ∶C等。基于APTT途径的一期法和基于发色底物法途径的二期法检测FⅧ∶C,测定患者血浆分别在37、25、4、-20及-80℃时的FⅧ∶C,测定56℃时患者血浆FⅧ∶C稳定性(一期法)及FⅧ蛋白的热稳定性(EILSA法);以长链PCR及序列特异PCR检测F8基因内含子22及内含子1倒位,对F8基因所有外显子及其侧翼序列测序;以PyMOL软件分析FⅧ突变蛋白的三维结构;构建His99Arg突变表达载体,转染HEK293T细胞后博莱霉素筛选稳定表达细胞株,测定培养上清FⅧ∶C稳定性。结果先证者血浆FⅧ∶C:一期法检测为14.7%,二期法检测为1.2%。和正常人相比,患者血浆在室温放置<2 h时FⅧ∶C迅速下降,>2 h后FⅧ∶C基本稳定在1%左右;在4℃孵育时FⅧ∶C下降的趋势和室温放置时基本相似;FⅧ∶C在37℃随孵育时间延长而明显下降,孵育10 min后FⅧ∶C下降了93.9%;不管在-20还是在-80℃,患者血浆放置1个月后,其FⅧ∶C基本完全丧失;56℃时患者血浆FⅧ∶C的半衰期仅为正常人的1/4(2 min/8 min);在56℃时患者FⅧ稳定性下降明显,重链和轻链解离速度是正常人的3倍(2 min/6 min)。F8基因分析发现患者存在g.30716A>G突变而导致His99Arg氨基酸改变;三维结构模型分析显示His99Arg突变后,Arg99残基与His1957及Ser1959残基间的距离由3.49和3.42分别变为4.19和2.39。体外表达研究显示培养上清液中的FⅧ具有与患者血浆FⅧ相似的不稳定表现。结论 His99Arg突变引起FⅧ空间结构发生变化和FⅧ重链和轻链解离速度加快。His99Arg突变后FⅧ∶C的稳定性明显下降,造成常规条件下FⅧ∶C检测结果变化大及一期法和二期法FⅧ∶C�
- 游国岭王学锋丁秋兰秦欢欢许冠群张利伟奚晓东王鸿利
- 关键词:DNA突变血友病A
- 三个遗传性血小板无力症家系的表型和基因型诊断分析
- 2010年
- 目的对3个遗传性血小板无力症(GT)家系进行临床表型和基因型诊断,探讨其分子发病机制。方法通过凝血指标检测、血小板(PLT)聚集试验、出血时间测定和流式细胞仪检测,明确3个遗传性GT家系的诊断,用PCR扩增先证者的αⅡb及β3基因的所有外显子及其侧翼序列,利用直接测序法进行基因序列分析。针对先证者的基因突变位点,对其家系成员进行相应外显子基因检测,同时选择100名健康人对照以排除基因多态性。结果 3个家系的先证者血小板计数及凝血四项检测均正常,而出血时间(BT)延长;血小板对多种诱聚剂反应低下,而对瑞斯托霉素反应基本正常;流式细胞术检测结果显示,家系2及家系3先证者为Ⅰ型GT,家系1先证者为Ⅱ型GT。基因检测结果显示3个家系的基因突变均位于αⅡb基因,分别是17号外显子14502C>T导致R(Arg)553X(stop)纯合无义突变;26号外显子18859C>T导致Q(Gln)860X(stop)纯合无义突变;15号外显子14103-14104insT、14105A>C、14106G>C、14107A>T导致氨基酸移码突变;其家系部分成员检测到相应位点的杂合突变。结论纯合无义突变18859C>T、纯合插入突变14103-14104insT及3个纯合性错义突变14105A>C、14106G>C、14107A>T是导致先证者2及先证者3发生Ⅰ型GT的原因,而14502C>T纯合无义突变是先证者1发生Ⅱ型GT的原因。其中,纯合性插入突变14103-14104insT及纯合性点突变14105A>C、14106G>C、14107A>T为国际首次报道的新突变。
- 秦欢欢王学锋许冠群陆晔玲丁秋兰戴菁奚晓东王鸿利
- 关键词:血小板无力症基因突变出血
- FⅧ His99Arg突变导致血友病A的分子发病机制研究被引量:1
- 2011年
- 目的探讨1例临床出血表现与凝血因子Ⅷ活性(Fvm:C)检测结果明显不符的血友病A患者表型、基因型诊断及其分子发病机制。方法凝血、抗凝及纤溶相关指标检测,一步法及发色底物法检测FⅧ:C,ELISA法检测FⅧ的抗原(FVIH:Ag)。活化部分凝血活酶时间(APTr)纠正实验筛查FⅧ抑制物;PCR扩增先证者F8基因的所有外显子及其侧翼序列,利用直接核苷酸测序法进行基因序列分析。针对先证者的基因突变位点,对其家系成员进行相应外显子基因检测;定点突变法构建B亚基缺失(760aa~1639aa)的人FⅧHis99Arg和His99Ala两种突变的表达质粒(pRC/RSV—BDhFⅧcDNA),两种突变质粒分别瞬时转染HEK293T细胞,测定细胞上清液中的FⅧ:C和细胞上清液及裂解液中的FVIU:Ag。结果先证者APTT延长,一步法及发色底物法检测的FⅧ:C均低于1.0%,血浆FⅧ:Ag为120.0%。APTT纠正试验阴性,其他凝血、抗凝及纤溶相关检测均未见异常。诊断为交叉反应阳性(CRM+)的血友病A。患者F、8基因直接核苷酸测序发现3号外显子存在28828A→G突变,导致His99Arg氨基酸改变,其母亲该位点为杂合突变。体外表达研究结果显示细胞上清液中His99Arg突变蛋白FⅧ:Ag及FⅧ:C分别为野生型的180.0%及5,8%,His99Ala突变蛋白FⅧ:Ag及FⅧ:C分别为野生型的45.0%和20.0%。Western blot显示,His99Arg突变质粒表达上清液中FⅧ蛋白含量较野生型明显增高,而His99Ala突变质粒表达上清液FⅧ蛋白含量较野生型减少。提示His99Arg为CRM+血友病A突变而His99Ala为CRM-血友病A突变。结论体外检测发现His99Arg和His99Ala两种FVI能够表达,但常规凝血检测His99Arg突变FⅧ基本无功能,而His99Ala凝血功能也降低。
- 秦欢欢王学锋丁秋兰陆晔玲戴菁奚晓东王鸿利
- 关键词:血友病ADNA突变分析分子发病机制