秦娣
- 作品数：29 被引量：54H指数：4
- 供职机构：南京医科大学基础医学院病原生物学系更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金霍英东青年教师基金江苏省高校自然科学研究项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学文化科学电子电信更多>>
- 重组慢病毒表达载体介导HIV-1 Vpr蛋白调控KSHV潜伏感染的初探被引量：3
- 2010年
- 目的 利用慢病毒载体系统包装含人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）病毒蛋白R（Vpr）的重组慢病毒,使之感染原发性渗出性淋巴瘤（PEL）细胞BCBL-1,并检测Vpr蛋白对细胞中卡波济肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）潜伏感染与裂解性复制的影响.方法 从实验室先前构建的重组真核表达质粒pCI-neo-Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen载体中构建成重组慢病毒质粒pHAGE-Vpr,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2及包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达,293T细胞培养上清经0.45 μm滤器过滤后即获得重组病毒悬液.慢病毒系列稀释后感染293T细胞,荧光计数法测定病毒滴度,逆转录PCR（RT-PCR）检测Vpr基因在293T细胞中的转录.以感染复数（MOI）为1的病毒量感染靶细胞BCBL-1,荧光显微镜观察靶细胞中GFP的表达,并利用RT-PCR和和免疫印迹（Western blot）技术分别检测Vpr基因在靶细胞中的转录和表达情况,同时检测KSHV裂解期基因复制与转录激活子（Rta）mRNA转录及蛋白表达.结果 经酶切鉴定、核酸序列测定和293T细胞中GFP表达证实成功包装了携带HIV-1Vpr基因的重组慢病毒,滴度为4×107TU/ml.重组慢病毒感染BCBL-1细胞后,细胞中有GFP表达,RT-PCR和Western blot均能够在相应位置检测到目的 基因Vpr的条带,并且Vpr降低了KSHV RtamRNA转录及蛋白表达水平.结论 重组慢病毒介导的HIV-1 Vpr蛋白过表达能够抑制KSHV裂解性复制、增强病毒的潜伏感染.
- 贾雪梅王平秦娣卢春
- 关键词：慢病毒卡波济肉瘤相关疱疹病毒
- 人类免疫缺陷病毒-1负调控因子通过调控糖原合成酶激酶-3β/β连环蛋白信号通路促进人类疱疹病毒8型病毒白细胞介素6诱导血管生成
- 2014年
- 目的 探讨糖原合成酶激酶（GSK）3β/β连环蛋白信号通路在HIV 1负调控因子（Nef）蛋白促进人类疱疹病毒8型（HHV-8）病毒白细胞介素6（vIL-6）诱导血管生成中的作用.方法 将GSK-3β突变质粒GSK-3β-S9A、显性负相质粒GSK 3β-DN及其对照质粒pcDNA3.1＋分别转染稳定表达HHV-8 vIL-6、HIV-1-Nef以及共表达vIL-6和Nef蛋白的内皮细胞,观察EA.hy 926细胞微管形成;将上述转染质粒的细胞接种鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）检测血管生成情况;Western印迹法检测转染上述质粒的细胞及CAM组织中GSK-3β/β连环蛋白通路中信号分子的表达水平.计量资料两两比较采用t检验.结果 转染GSK-3β-DN降低GSK-3β活性,能增强HIV-1 Nef蛋白促进vIL-6诱导微管形成（3.42比2.51,t=3.67,P＜0.01）和血管生成（6.25比3.97,t=4.06,P＜0.01）的能力.转染GSK-3β-S9A活化GSK-3β,则能显著抑制Nef蛋白的上述功能（0.62比2.51,t=8.48,P＜0.01;0.39比3.97,t=8.59,P＜0.01）.转染GSK-3β-DN后,细胞或组织中信号通路下游β连环蛋白（细胞中：3.53比2.07,t=6.60,P＜0.05;组织中：2.76比1.74,t=17.40,P＜0.01）、血管内皮生长因子（VEGF,细胞中：2.68比1.87,t=4.28,P＜0.01;组织中：2.20比1.39,t=7.08,P＜0.01）的表达升高;转染GSK-3β-S9A后,GSK-3β的磷酸化水平降低（细胞中：0.50比1.47,t=7.33,P＜0.01;组织中：0.35比1.97,t=10.72,P＜0.01）,β连环蛋白（细胞中：1.05比2.62,t=29.50,P＜0.01;组织中：0.79比1.77,t=5.72,P＜0.01）、VEGF（细胞中：0.74比2.16,t=20.95,P＜0.01;组织中：0.43比1.65,t=11.89,P＜0.01）的表达也随之减少.结论 GSK-3β/β连环蛋白信号通路参与调控HIV-1 Nef蛋白促进HHV-8 vIL-6诱导血管生成,极可能成为临床治疗艾滋病患者卡波齐肉瘤的一个潜在分子靶点.
- 姚水洪邱惠萍刘建军朱小飞秦娣严沁卢春
- 关键词：人免疫缺陷病毒1型负调控因子糖原合成酶激酶3白细胞介素6
- IL-10、IL-4及其信号通路在HSV-1激活KSHV复制中的作用
- 卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)感染是卡波济肉瘤(Kaposi’s sarcoma，KS)发生的必要条件，但如果没有其它协同因子的作用也不...
- 秦娣
- 关键词：单纯疱疹病毒1型白细胞介素-10IL-4信号通路
- 文献传递
- 卡波氏肉瘤病毒K1蛋白在血管内皮细胞中的表达及其功能初探
- 2013年
- 目的:获得稳定表达卡波氏肉瘤病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)K1蛋白的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),探究K1蛋白对HUVECs增殖和迁移能力的影响。方法:从本实验室已构建好的含KSHV K1基因的重组真核表达质粒pCI-neo-K1中扩增出K1基因,克隆入慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green中构建重组质粒pHAGE-K1。利用脂质体将pHAGE-K1与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,收集培养上清经0.45μm滤膜过滤即获得慢病毒悬液。病毒感染HUVECs,Western blot检测K1蛋白的表达。通过绿色荧光蛋白进行流式分选、Western blot验证获得稳定表达K1蛋白的HUVECs。通过细胞增殖实验和细胞划痕实验检测K1蛋白对HUVECs增殖和迁移能力的影响。结果:核酸序列测定证实,克隆的K1基因全长906 bp,与GenBank中登记的K1基因100%同源。Western blot结果显示,含K1基因的重组慢病毒感染的HUVECs在约46 000处可观察到一特异性条带,与预期的K1蛋白大小一致。流式分选获得稳定表达K1蛋白的HUVECs,其增殖能力与对照组相比显著增强(P<0.01),细胞迁移能力亦明显增加(P<0.05)。结论:成功包装了含KSHV K1基因的重组慢病毒。KSHV K1蛋白能够促进HUVECs增殖和迁移。
- 程晓东薛敏郝婷婷秦娣卢春
- 关键词：增殖迁移
- IKK2EE重组慢病毒载体的构建及其在NF-κB信号通路中的功能验证
- 2016年
- 目的:构建含IKK2EE的重组慢病毒载体,并检测其对核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的影响。方法:以真核表达质粒p MIGR1-IKK2EE为模板扩增出IKK2EE基因片段,并将其插入至慢病毒载体p CDHCMV-MCS-EF1-cop GFP中,构建重组质粒p CDH-IKK2EE。将此重组质粒和NF-κB虫荧光素酶报告质粒共同转染人胚肾上皮细胞(293 T细胞),24 h后检测IKK2EE对NF-κB活性的影响。将重组质粒p CDH-IKK2EE与包装质粒psPAX2和包膜质粒p MD2.G共同转染293 T细胞,包装表达IKK2EE的重组慢病毒,采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。将重组慢病毒感染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),通过免疫印迹法检测IKK2EE以及NF-κB信号通路中相关蛋白的表达,进一步采用免疫荧光法检测NF-κB p65亚基的核定位。结果:质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒p CDH-IKK2EE构建成功。虫荧光素酶报告实验结果显示,IKK2EE能够显著增强NF-κB报告质粒的活性。病毒梯度稀释法测得重组慢病毒滴度约为2×107pfu/m L。重组慢病毒感染HUVECs后,蛋白质印迹结果显示,细胞中磷酸化的NF-κB抑制子(inhibitor of NF-κB,IκB)激酶β(IKKβ)表达升高,IκBα表达下降以及磷酸化的p65表达上升。免疫荧光检测结果表明,重组慢病毒介导的IKK2EE能够显著促进HUVECs中NF-κB p65亚基入核。结论:成功构建了含IKK2EE的重组慢病毒载体,且其能够增强NF-κB信号通路活性。
- 薛雪胡敏敏秦娣卢春
- 关键词：核转录因子ΚBIKKΒ转染慢病毒
- HIV-1相关炎性细胞因子诱导人血管内皮细胞中潜伏感染KSHV的溶解性周期复制被引量：4
- 2005年
- 目的研究HIV21感染相关炎症细胞因子是否能够激活人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)中潜伏感染的卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV);探讨该激活作用是否由KSHVRta基因所介导。方法采用体外模拟系统,研究了与HIV-1感染T细胞诱生的细胞因子相似的重组人细胞因子对HUVEC中潜伏感染的KSHV复制的影响。通过Northernblot和定量PCR检测ORF26(该基因编码的病毒次要衣壳蛋白仅在KSHV被激活时表达)mRNA表达来分析KSHV的激活。运用KSHVRta基因启动子(KSHV复制时最先被激活的启动子)驱动的虫荧光素酶报告基因进一步证实并扩展研究结果。结果包括干扰素-γ(IFN2γ)、肝细胞生长因子P扩散因子(HGFPSF)及制瘤蛋白M(oncostatinM,OSM)在内的重组细胞因子不仅可诱导HUVEC中潜伏感染的KSHV发生溶解性周期复制,而且能增强Rta启动子活性。结论HIV-1感染相关的炎性细胞因子是诱导HUVEC中KSHV溶解性周期复制的因素,而且该过程至少有部分由KSHV的Rta启动子介导。
- 卢春唐桂霞曾怡钱超秦娣
- 关键词：细胞因子卡波济肉瘤相关疱疹病毒
- HSV-1作用于KSHV ORF50启动子区中特异性应答位点序列的初寻被引量：2
- 2011年
- 目的:构建卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)ORF50启动子系列截短序列克隆,初步寻找HSV-1作用于KSHV ORF50启动子区中特异性应答位点序列。方法:以KSHV基因组为模板,PCR扩增KSHVORF50启动子系列截短序列,克隆至含有虫荧光素酶(Luciferase)报告基因的基本载体pGL-3中,构建含ORF50启动子系列截短序列的重组Luciferase报告质粒。系列重组报告质粒经酶切鉴定和序列测定分析后,分别转染单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染后的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),进行Luciferase活性检测,计算并比较相对Luciferase活性单位(Relative luciferase activity unit,RLU)。结果:成功分离、克隆KSHV ORF50启动子系列截短序列;HSV-1感染随后转染重组质粒p50-95、p50-46和p50-17与转染p50-1500、p50-750、p50-375及p50-185相比,Vero细胞中Luciferase活性显著下降。结论:成功构建了含KSHV ORF50启动子系列截短序列的重组Luciferase报告质粒;HSV-1所对应的、能够主导ORF50启动子活性的最小顺式调控区位于-185 bp和-95 bp之间。
- 程伟郝婷婷王子盾朱小飞冯宁翰华立新秦娣卢春
- 关键词：KSHVHSV-1虫荧光素酶
- 人类疱疹病毒8型包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体的制备与鉴定被引量：4
- 2005年
- 目的:制备人类疱疹病毒8型(HHV-8)包膜糖蛋白K8.1的单克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法:用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导含重组质粒pGEX-6p-1+K8.1的大肠杆菌BL21表达谷胱甘肽-S-转移酶GST/K8.1融合蛋白,将以包涵体形式存在的融合蛋白进行变性、复性、复性后的GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化。以纯化的GST/K8.1融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术制备单克隆抗体。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选分泌K8.1单抗的杂交瘤细胞株。免疫组化染色(IHC)和Westernblot法鉴定单抗的特异性。结果:建立了一株稳定分泌抗K8.1单抗的杂交瘤细胞株,命名为3G10;IHC和Westernblot法显示,3G10株单抗能特异地识别HHV-8K8.1蛋白。结论:成功制备出抗HHV-8包膜糖蛋白K8.1的单克隆抗体。
- 张玲卢春曾怡钱超唐桂霞秦娣
- 关键词：人类疱疹病毒8型包涵体单克隆抗体
- 卡波氏肉瘤病毒K9基因重组慢病毒表达载体的构建及其编码蛋白功能初探被引量：1
- 2016年
- 目的:构建卡波氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)K9基因的重组慢病毒载体,并探究K9基因编码的病毒干扰素调节因子1(viral IFN regulatory factor 1,v IRF1)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖的影响。方法:根据K9基因的核酸序列设计聚合酶链式反应(PCR)的上下游引物。以实验室已有的真核表达载体p CI-K9-Flag为模板,PCR扩增K9基因序列。PCR产物经限制性内切酶双酶切后插入慢病毒载体p HAGE-CMVMCS-Izs-Green(简称p HAGE)中,构建重组慢病毒质粒p HAGE-K9。将p HAGE-K9质粒与包膜质粒p MD2.G、包装质粒ps PAX2共同转染人胚肾上皮细胞(293 T细胞),包装K9基因的重组慢病毒。采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。慢病毒感染HUVECs后,观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,蛋白质印迹法检测HUVECs中K9编码的v IRF1蛋白的表达。采用流式分选技术获得稳定表达v IRF1蛋白的HUVECs。运用细胞增殖实验检测v IRF1对HUVECs增殖的影响。结果:核酸序列测定结果表明,重组慢病毒质粒p HAGE-K9构建成功。蛋白质印迹结果显示,K9基因重组慢病毒感染HUVECs后其编码蛋白成功表达。细胞增殖实验结果表明,稳定表达v IRF1的HUVECs增殖能力显著强于对照组。结论:KSHV K9基因编码的v IRF1能够促进HUVECs的增殖。
- 尚元翠卢春秦娣
- 关键词：基因慢病毒人脐静脉血管内皮细胞
- 卡波济肉瘤相关疱疹病毒包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体的鉴定被引量：1
- 2006年
- 目的:对已制备并经初筛的卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体进行特异性鉴定。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA),经3次克隆选择,筛选出能稳定分泌针对K8.1蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株共9株。采用Westernblot法评价9株杂交瘤细胞培养上清识别原核表达重组K8.1蛋白和原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1中KSHVK8.1包膜糖蛋白的能力。结果:筛选了9株能够稳定分泌抗K8.1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;Westernblot法显示,9株单抗均能特异性识别原核表达K8.1/GST融合蛋白和BCBL-1中KSHVK8.1包膜糖蛋白。结论:成功制备了KSHV包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体。
- 姚水洪卢春张玲汤巧曾怡唐桂霞秦娣钱超
- 关键词：卡波济肉瘤相关疱疹病毒单克隆抗体酶联免疫吸附试验WESTERNBLOT
