王洪峰
- 作品数：35 被引量：110H指数：5
- 供职机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划黑龙江省科技攻关计划项目国家重点科技攻关计划项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 猪氨基肽酶N病毒结合受体核心区对TGEV在ST细胞中复制影响的研究被引量：1
- 2023年
- 为研究与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)结合的猪氨基肽酶N(pAPN)受体核心区对TGEV复制以及细胞功能的影响,本研究检索并分析pAPN与TGEV的结合位点,结果显示,敲除pAPN aa668~aa963对其酶活性无影响。因此,利用CRISPR/Cas9技术构建pAPN与TGEV结合位点敲除细胞系,经PCR和western blot鉴定结果显示,正确构建一株敲除pAPN aa668~aa963的ST细胞系,即敲除pAPN 15-21外显子,命名为KO-ST-15。采用CCK-8和细胞划痕方法检测KO-ST-15细胞的增殖和细胞迁移活性,结果显示,敲除pAPN 15-21外显子对ST细胞增殖和迁移活性均无显著影响。利用RT-qPCR和IFA检测KO-ST-15感染TGEV后病毒复制拷贝数和N蛋白的表达,结果显示,敲除pAPN 15-21外显子可极显著抑制TGEV在ST细胞系中的复制(P<0.001)。利用RT-qPCR检测KO-ST-15感染TGEV后炎症相关基因转录水平变化,结果显示,TGEV感染后KO-ST-15中的IL-6、IL-8和NLRP3(NOD-like receptor protein 3)mRNA转录水平无显著变化,但RIG-I和MDA5的转录水平显著上调(P<0.05)。上述结果首次表明,敲除pAPN15-21外显子能够极显著抑制TGEV在ST细胞中的复制,但细胞KO-ST-15的正常生理功能无变化,TGEV不能进入敲除pAPN 15-21外显子的细胞中引起炎症反应,该结果为进一步培育抗病育种猪提供参考依据和候选方案。
- 史鑫琪季朝阳陈晓彤张子博张鑫郭慧娟田璐王洪峰陈洪岩王靖飞冯力夏长友孟庆文
- 关键词：猪传染性胃肠炎病毒ST细胞
- 敲除CRFK细胞氨基肽酶N对猫传染性腹膜炎病毒复制影响的研究被引量：1
- 2024年
- 猫氨基肽酶N(fAPN)参与猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的感染过程,为研究f APN对FIPV复制的影响,本研究针对f APN第14外显子设计了1对sg RNA,将sg RNA退火后克隆至p X458质粒中,构建同时含有Cas9蛋白和sg RNA的重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定正确后,瞬时转染猫肾细胞(CRFK)中,24 h后通过流式细胞仪分选带有绿色荧光的单克隆细胞。单克隆细胞经稳定传代培养后,细胞中的绿色荧光消失,对细胞进行PCR和测序,结果显示:3株单克隆细胞在f APN第14外显子有1个碱基的插入,造成移码突变,导致f APN不能正常表达,表明敲除f APN蛋白的CRFK细胞系正确构建,命名为KO-APN14。将FIPV分别感染CRFK细胞及培养20代的KO-APN14细胞,48 h后通过间接免疫荧光试验(IFA)检测FIPV N蛋白的表达;将FIPV分别感染CRFK细胞及KO-APN14细胞,在感染4 h、12 h、24 h、36 h时采用RT-q PCR分别检测FIPV N基因、视黄酸(维甲酸)诱导基因I(RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)、Toll样受体3(TLR3)、干扰素β(IFN-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)的转录水平。IFA结果显示:感染FIPV的CRFK细胞出现绿色荧光,未感染FIPV的CRFK细胞、未感染FIPV的KO-APN14细胞及感染FIPV的KO-APN14细胞均无绿色荧光;RT-q PCR检测FIPV感染各细胞后病毒N基因的转录水平,结果显示:与感染FIPV的CRFK细胞相比,感染FIPV的KO-APN14细胞能够极显著抑制FIPV N基因的转录(P<0.0001);RT-q PCR检测FIPV感染各细胞后上述各细胞因子的转录水平,结果显示:与感染FIPV的CRFK细胞相比,感染FIPV的KO-APN14细胞能够抑制RIG-I、MDA5、TLR3、IFN-β、IL-6、IL-10、TNF-α及f APN的转录。综上所述,f APN是FIPV在侵入细胞及病毒复制过程中发挥重要作用,并在FIPV引起的炎症反应过程中起关键作用。本研究为f APN在免疫炎症反应中作用的研究提供科学依据,并为培育基因编辑抗病育种猫奠定实�
- 陈晓彤郭慧娟田进王洪峰史鑫琪陈洪岩夏长友王金泉孟庆文
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒GD3株的分离鉴定及其分子特征被引量：1
- 2009年
- 2005年从广东发病猪场采集的猪繁殖与呼吸综合征疑似病料中,分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),命名为GD3株。采用RT-PCR、IFA对分离毒株进行鉴定,并在Marc-145细胞上完成了病毒的增殖和理化性质的鉴定。应用RT-PCR方法扩增出GD3株的6条基因大片段,扩增产物克隆于pMD18-T载体鉴定后测序,同时应用RACE技术对GD3株的5'末端进行扩增和测序。结果表明GD3株基因组全长15425nt,包含个9开放阅读框,5'UTR长189nt,3'UTR长150nt。序列分析结果表明,GD3株在分子遗传演化上介于PRRSV变异毒株(HuN4株、JXA1株)和CH-1a之间,与HuN4和JXA1之间的相似性为97.1%和97.2%;与CH-1a的核苷酸相似性为94.9%。
- 马平蔡雪辉刘永刚石文达王淑杰王洪峰李成君张琪
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒
- 发酵大豆异黄酮抑癌作用的研究
- 本实验利用少孢根霉发酵大豆制成丹贝,采用MTT比色法测定纯度为35％的丹贝及大豆异黄酮提取物对SP2/0和Hela细胞株的抑制作用,研究各单位对肿瘤细胞的抑制率.结果显示发酵大豆异黄酮在浓度为20μg/ml时,对SP2/...
- 卢雁王洪峰王立群
- 关键词：丹贝异黄酮MTT比色法抑癌作用发酵大豆
- 文献传递
- 应用荧光定量RT-PCR方法检测PRRSV变异株在仔猪体内动态分布被引量：5
- 2010年
- 为进一步了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株(HuN4株)在体内的动态分布规律和特点,探讨病毒对组织器官的嗜性,本研究将HuN4株和细胞传代致弱毒株HuN4-F65人工感染40日龄健康仔猪,分别于感染后1d、3d、5d、7d、10d、14d、21d和28d各迫杀2头,并应用建立的荧光定量RT-PCR方法对脑、颌下淋巴结、扁桃体、肺脏、肝脏和十二指肠等组织及血清中的PRRSV进行定量检测。结果显示:感染后HuN4组各器官病毒载量比HuN4-F65组高100倍,病毒载量峰值期出现在感染后7d,随后呈下降趋势。HuN4株在仔猪体内分布广泛,在21d的试验期内持续存在,并且各器官的病毒载量呈正态分布规律;而HuN4-F65株血清病毒载量较低,并且集中在单核巨噬细胞相对密集的扁桃体和颌下淋巴结,与HuN4株主要嗜性器官肺脏相比发生了改变。
- 荣福龙刘永刚孙广力王淑杰王洪峰石文达李丽琴徐明明孙刚田志军蔡雪辉
- 关键词：PRRSV变异株荧光定量RT-PCR
- Vero细胞nucleolin和fibrillarin基因的克隆及序列分析
- 2012年
- 为克隆及分析Vero细胞的nucleolin和fibrillarin基因,本研究根据人类的相关基因设计两对引物,从Vero E6细胞中扩增nucleolin和fibrillarin基因。测序结果显示nucleolin基因序列长度为2 139 bp,编码712个氨基酸;fibrillarin基因序列长度为969 bp,编码322个氨基酸。与GenBank中登录的人类相应序列相似性高达97%,处于同一进化分支,表明该基因具有种属特异性并且保守性很高;同时利用软件对nucleolin和fibrillarin预测蛋白进行了生物信息学分析,从而为研究冠状病毒核蛋白与核仁蛋白相互作用奠定了基础。
- 石达陈建飞时红艳王洪峰张鑫刘孝珍张莎刘随心王璐冯力
- 关键词：核仁素纤维蛋白克隆
- 猪伪狂犬病活疫苗(TP株)冻干保护剂筛选和冻干工艺的优化
- 2023年
- 通过调整蔗糖明胶保护剂中蔗糖和明胶的比例、调整病毒液和冻干保护剂的添加比例,确定蔗糖添加量为40%、明胶添加量为8%配制的保护剂,病毒液与其按8∶1的比例冻干的制品性状较好,病毒含量较高。分别采用速冻法和慢冻法对制品进行冻干,结果表明,速冻法冻干后样品性状较好,病毒含量较高,因此确定采用速冻法对样品进行冻干。对预冻时间、一期干燥第一步干燥温度、干燥时间、加热的最高许可温度及时间进行了优化,结果表明,预冻时间1 h、一期干燥第一步干燥温度为5~10℃、干燥时间为14 h、干燥温度25℃维持4 h,为最优的冻干曲线。
- 王洪峰关双李雪房良夏伟梁与时孟相秋张剑田志军
- 关键词：冻干保护剂冻干工艺
- 猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒疫苗株及其应用
- 本发明公开了猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome virus)弱毒疫苗株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.1883。本发明弱毒疫苗株遗传变异...
- 蔡雪辉王洪峰刘永刚郭宝清柴文君
- 文献传递
- 猪链球菌菌株及其用途
- 本发明公开了猪链球菌(Streptococcus suis)的一种新菌株，微生物保藏号是CGMCC No.1316，保藏日期是2005年2月21日；本发明菌株可作为科研工作者标准的试验用菌株；通过该菌株可以了解该菌的DN...
- 李艳华蔡雪辉姜成刚刘永刚王洪峰柴文君
- 文献传递
- 猪氨基肽酶N不是猪德尔塔冠状病毒入侵宿主细胞的受体被引量：8
- 2017年
- 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是一种新出现的冠状病毒,能够引起猪只发生呕吐和水样腹泻,临床症状与猪流行性腹泻(PED)和猪传染性胃肠炎(TGE)相似。相关研究表明猪氨基肽酶N(pAPN)是PED病毒(PEDV)和TGE病毒(TGEV)入侵宿主细胞的功能性受体。为研究pAPN是否是PDCoV入侵宿主细胞的受体,本研究以TGEV为指示病毒,通过BHK-pAPN细胞感染试验、pAPNRNA干扰试验、ST细胞过表达pAPN试验、可溶性pAPN阻断试验,发现BHK-pAPN细胞是PDCoV非易感细胞,在易感细胞ST上沉默和过表达pAPN对PDCoV的增殖并无影响,可溶性pAPN不能阻止PDCoV感染ST细胞。这些研究结果表明pAPN不是PDCoV入侵宿主细胞的受体,而且对PDCoV的增殖无影响。
- 卢曼曼张家林王洪峰时洪艳张鑫袁婧石达刘建波陈建飞冯力
- 关键词：受体
