沈智俊
- 作品数：3 被引量：8H指数：2
- 供职机构：武汉生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 狂犬病病毒CTN株反向遗传系统的改造及拯救被引量：6
- 2015年
- 目的对狂犬病病毒CTN株反向遗传系统进行改造,并拯救改造后的狂犬病病毒。方法应用基因定点突变技术分别对狂犬病病毒CTN株G蛋白的第194位和333位氨基酸进行定点突变,将突变后的G蛋白基因替换原有反向遗传系统中的G蛋白基因,同时对突变后的G蛋白基因进行拷贝,分明构建含有1、2和3个改造后G蛋白基因全长序列的感染性克隆,并将其分别与辅助质粒共转染BSR细胞,采用直接免疫荧光实验(DFA)和RT-PCR法鉴定重组病毒。结果 G蛋白的第194位天冬酰胺突变为丝氨酸,第333位谷氨酰胺突变为谷氨酸,获得含有1、2和3个突变后G蛋白基因的狂犬病病毒CTN株反向遗传系统,并拯救出重组狂犬病病毒。结论成功对狂犬病病毒CTN株反向遗传系统进行了改造,并拯救出了重组病毒,为研制安全、稳定、高效的新型狂犬病病毒疫苗奠定了基础。
- 解庭波明平刚唐芳黄思佳沈智俊王月徐葛林严家新
- 关键词：狂犬病病毒反向遗传学定点突变G基因
- 甲型肝炎病毒病毒样颗粒的制备被引量：2
- 2013年
- 目的制备甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus,HAV）病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）,为研制HAV VLPs疫苗奠定基础。方法利用RT-PCR法从HAV HM175-clone4株中扩增P1-2A、P2和P3基因片段。将P1-2A和P3基因亚克隆至pFastBacDual载体,构建重组表达质粒pFastBacDual-P1-P3,转化大肠杆菌DH10BacTM,构建重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-P1-P3,转染昆虫细胞sf-9进行重组杆状病毒的包装。重组杆状病毒vAcP1P3扩增后,感染昆虫细胞Tn-5,培养72 h后,收获表达产物,经原位免疫荧光、EIA、Western blot法及透射电镜检测HAV VLPs的表达。表达产物经超滤及蔗糖密度梯度离心纯化。结果重组表达质粒和重组穿梭质粒分别经双酶切和PCR鉴定证明构建正确。第2、3、4代重组杆状病毒的滴度分别为1.58×105、2.13×107、3.98×107TCID50/ml。vAcP1P3转染sf-9细胞72 h后,可见HAV蛋白的表达;vAcP1P3转染Tn-5细胞后,表达的HAV抗原主要存在于沉淀中,且含量明显高于野生型杆状病毒沉淀样品（P〈0.001）;Wentern blot结果表明,与野生型杆状病毒组相比,HAV VLPs样品中VP3的含量相对较少,HAV VLPs样品可见相对分子质量约30 700的VP1片段及相对分子质量约27 700的VP3片段;透射电镜观察可见大小约50 nm的VLPs颗粒,略大于天然HAV颗粒。纯化的HAV蛋白主要存在于40%~50%的蔗糖梯度中,提示有VLPs形成。结论成功制备了HAV VLPs,为甲肝新型疫苗的研制奠定了基础。
- 沈智俊吴杰解庭波吕宏亮王云陈新文严家新沈智俊
- 关键词：甲型肝炎病毒病毒样颗粒杆状病毒表达系统
- 安徽省2011年新分离的19株狂犬病病毒的N基因序列分析
- 2013年
- 目的对安徽省2011年新分离的19株狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)的N基因进行序列分析,并比较其与代表性RABV街毒株及疫苗株之间的差异。方法采集安徽省淮北地区狗肉市场的犬脑组织121份,伤人犬脑组织10份,采用直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法检测RABV抗原,并通过颅内接种昆明乳鼠进一步鉴定毒株;RT-PCR扩增分离病毒的N基因,与pMD18-T载体连接测序后,与代表性RABV街毒株及疫苗株的N基因序列进行比对,并进行遗传学分析。结果在送检的131份犬脑组织样品中检出RABV阳性19株,其中伤人犬脑组织阳性率为90%,狗肉市场犬脑组织阳性率为8.26%。19株RABV N基因核苷酸序列同源性为97.5%～99.7%,推导的氨基酸序列同源性为98.7%～100%;与代表性人用和兽用RABV疫苗株相比,N基因核苷酸序列同源性为85.4%～89.9%,推导的氨基酸序列同源性为94.9%～99.1%,核苷酸序列的变异主要为同义突变。分离的19株RABV在系统进化树上高度聚集,与以往国内分离的代表性街毒株系统进化关系较近,在同一个分支(HN10除外)与我国疫苗株CTN-181株亲缘关系最近,处于同一个亚群。结论从安徽省伤人犬和狗肉市场的犬脑组织中成功分离并鉴定了19株RABV,这些病毒株均属于基因I型RABV,且具有地域性特征。本研究对特定区域RABV的流行及监测具有一定的意义。
- 吴杰解庭波黄思佳沈智俊王月朱理业曹明华刘红徐葛林严家新
- 关键词：狂犬病病毒N基因
