张冠冠
- 作品数：5 被引量：7H指数：2
- 供职机构：华南农业大学动物科学学院国家生猪种业工程技术研究中心更多>>
- 发文基金：广东省科技计划工业攻关项目国家科技重大专项广东科技计划项目更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 木聚糖酶-甘露聚糖酶融合酶基因Linker优化及其在猪肾pK15细胞中共表达被引量：5
- 2013年
- [目的]构建木聚糖酶（XynB）与甘露聚糖酶（ManA）的融合酶基因，使其能在哺乳动物表达系统中表达并分泌兼有木聚糖酶和甘露聚糖酶活性的双功能融合酶。[方法]利用基因融合技术（SOE—PCR），把11条Linker融合到木聚糖酶（XynB）和甘露聚糖酶（ManA）基因间，构建真核表达载体，经转染猪肾细胞（pKl5）收集细胞培养液，用DNS法测定其酶活并进行酶学分析。[结果]经表达分析12条不同Linker构建的融合酶与亲本酶酶活，发现用Linkera3、pS3和具有“自我剪切”能力T2A构建的融合酶在木聚糖酶和甘露聚糖酶活性都显著高于两亲本酶。融合酶XynB-a3-ManA的木聚糖酶和甘露聚糖酶酶活比亲本酶XynB和ManA分别提高了54．06％和104．40％；该融合酶在酸性环境3．0—7．0起作用，对pH3．08．0具有一定的耐受力。[结论]首次获得可在哺乳动物系统表达分泌的增强型双功能XynB—ManA融合酶。
- 张献伟张冠冠吴珍芳孟繁明刘德武张茂许卫华郑恩琴贺晓燕李真李紫聪
- 关键词：木聚糖酶甘露聚糖酶LINKER酶活测定
- 抗猪圆环病毒2型的长发夹RNA(IhRNA)真核表达载体的构建
- 本文经过PCR、酶切和测序鉴定之后，确定4个干扰质粒和2个靶质粒都已经构建好。转染后，在显微镜下观察到转染干扰载体的细胞表达了绿色荧光蛋白，而转染2个靶载体的细胞也表达了红色荧光蛋白，证明质粒都构建成功。干扰效率有待于进...
- 邹娴李紫聪刘德武张冠冠周庆丰吴珍芳
- 关键词：PCV2RNAI技术转基因猪
- 转manA基因小鼠F_1代表达效果的检测分析
- 2014年
- 将携带β-甘露聚糖酶基因manA的转基因FVB原代小鼠与野生型FVB小鼠进行繁殖得到F1代,通过PCR和Southern blot鉴定出F1代转基因小鼠。提取转基因小鼠腮腺、舌下腺、下颌下腺、心脏、肝脏等组织的总RNA,通过RT-PCR检测出manA在转基因小鼠的腮腺和舌下腺组织特异性表达。进行定量PCR验证出manA基因在302号家系小鼠的舌下腺中表达量最高,证明β-甘露聚糖酶基因manA在转基因小鼠的腮腺和舌下腺特异性表达成功。对转基因小鼠唾液进行收集测定β-甘露聚糖酶活性,在302号家系中检测到酶活性较高。通过代谢试验测定饲料中粗蛋白、粗纤维和粗脂肪的消化率,结果显示,与非转基因小鼠相比,302号家系转基因小鼠对饲料中粗蛋白、粗纤维的表观消化率无明显差异,而粗脂肪的消化率得到显著提高;304号家系转基因小鼠对饲料中粗蛋白、粗脂肪、粗纤维消化率方面均无明显差异。
- 张茂李紫聪许惠张冠冠刘德武吴珍芳
- 关键词：转基因
- 木聚糖酶-甘露聚糖酶融合酶的真核表达分泌与部分酶学性质分析
- 本研究尝试利用α-螺旋刚性肽a3，对木聚糖酶基因和甘露聚糖酶基因进行融合，构建可在猪细胞内进行高效表达和分泌的耐酸性木聚糖酶和甘露聚糖酶融合酶(XynB-a3-ManA)，为环保型转基因猪的研究打基础。
- 张冠冠张献伟刘德武李紫聪黄妙容张茂吴珍芳
- 关键词：木聚糖酶甘露聚糖酶转基因
- 转β-甘露聚糖酶基因克隆猪的制备与分析被引量：2
- 2016年
- 【目的】将前期构建的含有黑曲霉β-甘露聚糖酶基因manA的质粒p PSPBGP-manA转染杜洛克猪胎儿成纤维细胞,利用G418筛选出转基因细胞系,通过体细胞核移植方法生产出转manA基因猪,利用分子生物学方法对转基因猪进行阳性鉴定、基因及蛋白表达水平的检测,同时测定转基因猪唾液β-甘露聚糖酶酶活、粪便营养物质含量,旨在为生产及进一步研究转manA基因猪提供一些科学依据。【方法】用限制性内切酶Not I将质粒p PSPBGP-manA线性化并通过脂质体法将其转入杜洛克猪胎儿成纤维细胞,然后用不同浓度的G418进行筛选、维持培养,将筛选后的细胞进行体细胞核移植生产克隆猪;克隆猪出生后采取尾组织样用酚-氯仿法提取基因组DNA进行PCR及Southern blotting鉴定阳性转基因猪;收集转基因猪唾液并利用DNS法进行β-甘露聚糖酶活性测定,同时收集转基因猪粪便测定粪便中营养物质含量;取转基因猪的腮腺、颌下腺、舌下腺、心脏、肝脏等组织并用Triol法提取RNA,然后进行RT-PCR鉴定manA基因的表达,再进行相对定量PCR检测manA基因在不同个体及组织间的表达差异;通过Western blotting技术分析转基因猪外源性manA基因的蛋白表达水平。【结果】经G418筛选后进行PCR鉴定得到阳性转基因细胞系;通过体细胞核移植方法生产出21头克隆猪,经PCR及Southern blotting鉴定出16头转基因猪,阳性率为76%;转基因猪唾液中β-甘露聚糖酶的活性为(0.092±0.003)U·m L-1,粪便中粗蛋白含量明显降低;经RT-PCR、相对定量PCR鉴定,manA基因在转基因猪腮腺和舌下腺组织中特异表达,其它组织不表达,腮腺组织表达量高于舌下腺组织;Western blotting检测发现在腮腺和舌下腺组织中有manA的表达。【结论】通过G418筛选得到转manA基因细胞系并成功得到转manA基因猪,外源manA基因能够在转基因猪中腮腺和舌下腺组织特异性表达,为转manA�
- 张茂张冠冠刘德武蔡更元吴珍芳李紫聪
- 关键词：Β-甘露聚糖酶转基因克隆猪
