尚伟龙
- 作品数：18 被引量：50H指数：4
- 供职机构：第三军医大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市自然科学基金国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生自动化与计算机技术电子电信更多>>
- 广州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子分型及耐药性分析被引量：14
- 2013年
- 目的了解广州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)分子型别及其对临床常用抗生素的耐药情况,为防控MRSA感染提供依据。方法收集2010年10月至2011年4月广州地区两家教学医院临床分离的MRSA 142株,应用SCCmec、spa、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)等方法进行分子分型,检测这些菌株对苯唑西林、克林霉素等17种临床常用抗生素的药物敏感性,分析临床MRSA的耐药情况。结果 142株MRSA中121株为医院获得型金葡菌(HA-MRSA),20株为社区获得型金葡菌(CA-MRSA),1株未定型MRSA。这些MRSA可分为16种spa型,8种ST型及13种PFGE型。HA-MR-SA中的ST239-MRSA-Ⅲ-t030、ST239-MRSA-Ⅲ-t037和ST5-MRSA-Ⅱ-t002为主要流行克隆,也发现CA-MRSA中ST59-MR-SA-Ⅳ-t437克隆的流行,且这些流行克隆有特定的耐药谱。结论广州地区流行的金葡菌仍以HA-MRSA为主,同时也有一定量的CA-MRSA检出和传播,且CA-MRSA的多重药物敏感性已在下降。
- 程航曾方银胡启文袁文常周人杰张霞袁吉振尚伟龙杨杰胡珍朱军民饶贤才
- 关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子分型脉冲场凝胶电泳多位点序列分型耐药谱
- 基于Antares2的金黄色葡萄球菌生物发光示踪系统的构建被引量：1
- 2023年
- 目的构建融合型荧光素酶标记的金黄色葡萄球菌示踪菌株,建立金葡菌示踪系统。方法采用同源重组技术将融合型荧光素酶Antares2编码基因敲入到金葡菌USA300基因组中,与金葡菌烯醇酶编码基因eno融合,构建稳定表达的示踪菌株。将示踪菌株与不同的底物混合,检测生物发光强度差异,筛选合适的菌株/底物示踪系统,并探究其在体外和体内的敏感性。结果通过构建基因敲入质粒pBT2-eno-antares2,转化金葡菌USA300菌株中进行基因敲入菌株筛选,经DNA测序和Western blot鉴定示踪菌株USA300/Eno-Antares2构建成功。细菌生长曲线和溶血实验表明所构建的示踪菌株与野生型USA300无明显差异。将示踪菌与DTZ、FUR和HFZ底物混合,肉眼均可观察到发光。不同浓度不同底物分析显示,USA300/Eno-Antares2/HFZ组成的系统发光性能最优,体外发光示踪的敏感性为50 CFU(菌落形成单位),小鼠体内示踪敏感性为100 CFU。结论金葡菌USA300/Eno-Antares2/HFZ示踪系统性能佳,可用于金葡菌感染、定植、播散等研究。
- 胡珍尚伟龙饶贤才
- 关键词：金黄色葡萄球菌生物发光荧光素酶
- SigB(Q225P)突变促进金黄色葡萄球菌生物被膜形成被引量：1
- 2017年
- 目的探讨金黄色葡萄球菌Sig B(Q225P)突变对其生物被膜形成能力的影响。方法比较临床分离金葡菌(XQ株)与实验室传代获得菌落颜色变白之XQW株的生物学特性,通过结晶紫染色法以及激光共聚焦检测菌株的生物被膜形成。进行XQ及XQW全基因组测序,比较相关基因,寻找突变位点。分别扩增sigB(Q225P)基因及其上游片段,经酶切后连接穿梭载体p BT2,构建同源重组质粒p BT2-sigB(Q225P),电转化至金葡菌RN4220,再将经RN4220修饰后的质粒电转入Newman。利用p BT2质粒对温度敏感的特点筛选Newman-sigB(Q225P)。利用同样的方法构建sigB敲除菌株Newman-△sigB,并构建回补菌株Newman-△sigB/sigB以及Newman-△sigB/sigB(Q225P)。比较这些菌株的生物被膜形成差异。结果 XQW株在液体培养基中呈絮状生长,结晶紫法以及激光共聚焦检测结果显示其生物被膜形成能力显著强于野生株,全基因组测序和比较发现XQW的sigB基因发生(Q225P)突变。构建的同源重组质粒p BT2-sigB(Q225P)及p BT2-△sigB转化金葡菌Newman后,经筛选,获得Newman-sigB(Q225P)及Newman-△sigB菌株;回补质粒p LI50-sigB及p LI50-sigB(Q225P)转化Newman-△sigB,筛选获得回补菌株Newman-△sigB/sigB及Newman-△sigB/sigB(Q225P)。经过结晶紫染色法及激光共聚焦测定生物被膜,发现Newman-sigB(Q225P)较野生株的生物被膜形成能力显著升高,与XQW的生物被膜形成能力强于XQ野生型的表型相一致;Newman-△sigB/sigB(Q225P)的生物被膜形成能力明显高于Newman-△sigB/sigB。结论 Sig B(Q225P)具有促进金葡菌生物被膜形成的能力。
- 刘慧尚伟龙彭华刚周坤胡珍周人杰饶贤才
- 关键词：金黄色葡萄球菌生物被膜同源重组SIGB
- 乌鲁木齐地区金黄色葡萄球菌分离株的分子分型与耐药性分析被引量：11
- 2016年
- 目的了解乌鲁木齐地区金黄色葡萄球菌临床分离株的分子特征及其对临床常用抗生素的耐药情况。方法收集2010年6月至2012年12月期间乌鲁木齐地区一所大型综合医院临床分离的86株金黄色葡萄球菌,在鉴定区分耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA)的基础上,应用SCCmec分型、spa分型、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、脉冲场凝胶电泳分型(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)、agr分型等葡萄球菌分子分型方法进行分析,检测pvl毒力基因的携带率,检测菌株对苯唑西林、红霉素、四环素等13种临床常用抗生素的耐药性,分析菌株的耐药情况及耐药基因。结果 86株金葡菌中31株为MRSA,55株为MSSA。31株MRSA分为8种spa型和7种ST型,优势流行克隆为ST239-MRSA-Ⅲ-t030(71%,22/31)。55株MSSA分为23种spa型、16种ST型和8个PFGE聚类组,agrⅠ型占56.4%(31/55)。MSSA菌株的pvl毒力基因检出率为49.1%(27/55),MRSA为38.7%(12/31)。药敏结果显示31株MRSA均为多重耐药(multidrugresistant,MDR)菌株,55株MSSA中有31株为MDR菌株。结论乌鲁木齐地区流行的MRSA以ST239-MRSA-Ⅲ-t030为主,而MSSA表现出较高遗传多样性,发现有t11413,ST121等新的型别流行。
- 杨延成程航胡珍袁文常尚伟龙饶青胡启文杨杰刘正祥袁吉振张骁鹏彭华刚刘慧朱军民伏建峰饶贤才
- 关键词：分子分型耐药谱多重耐药乌鲁木齐
- WalK(S221P)突变影响万古霉素中等耐药金黄色葡萄球菌毒力的作用被引量：7
- 2020年
- 目的探讨WalK(S221P)突变对万古霉素中等耐药金黄色葡萄球菌(vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus, VISA)毒力的影响及其机制。方法采用转录组测序比较VISA菌株XN108及其WalK(S221P)回复菌株K65的毒力基因表达差异,利用RT-qPCR检测菌株毒力基因的表达变化,溶血实验比较菌株的溶血能力。采用同源重组技术在金葡菌中引入WalK(S221P)突变,E-test检测菌株的耐药性。凝胶阻滞实验(EMSA)检测WalKR对靶基因调控区的结合能力。结果转录组测序结果显示,K65中多种重要毒力因子基因的表达上调(P<0.01),调控系统Agr的活性增强,溶血能力恢复。将WalK(S221P)突变引入USA300菌株后,其耐药性升高,毒力因子表达水平及溶血活性降低;EMSA证实WalKR对金葡菌Agr有直接调控作用;敲除agrA基因后,引入WalK(S221P)突变仍可使USA300agrA对万古霉素的耐药性升高,但毒力基因的表达水平及溶血活性改变不显著。结论 WalK(S221P)突变影响VISA毒力是通过Agr实现的,该突变导致WalKR的活性降低,激活Agr的能力下降,最终影响VISA菌株的毒力。
- 饶一凡毛旭虎彭华刚尚伟龙饶贤才
- 关键词：毒力
- 金黄色葡萄球菌agr基因敲除及其对膜泡毒力影响被引量：7
- 2014年
- 目的利用同源重组技术构建金黄色葡萄球菌RN4220附属基因调节系统(agr)的敲除株,探讨agr基因缺失对金黄色葡萄球菌分泌膜泡毒力的影响。方法分别扩增agr基因的上下游同源臂,利用重叠PCR获得agr基因上下游同源臂的融合片段,经酶切后连接敲除载体PYT3,构建同源重组质粒pYT3::Δagr,电转化至金黄色葡萄球菌RN4220,利用pYT3质粒对温度敏感的特点筛选agr缺失的突变株。分别制备野生菌RN4220和突变株RN4220::Δagr的膜泡,小鼠毒力实验观察agr基因缺失后对金黄色葡萄球菌膜泡毒力的影响。结果同源重组质粒pYT3::Δagr通过酶切鉴定证明构建成功;经PCR及DNA测序证实获得金黄色葡萄球菌RN4220 agr缺失突变株,重组效率为5.6%;agr突变株与野生株相比,其分泌膜泡的毒力大大降低,72 h内小鼠存活率为100%。结论 agr基因缺失后能够显著降低膜泡的毒力。
- 袁吉振杨杰袁文常胡珍尚伟龙张霞朱军民胡启文周人杰饶贤才
- 关键词：金黄色葡萄球菌膜泡同源重组
- 登革1型病毒GZ2002株全基因组测序与分析被引量：3
- 2012年
- 目的对2002年分离自广州登革热患者的1型登革病毒GZ2002株进行全基因组序列测定及分析,为探讨其来源和基因组特征提供依据。方法利用C6/36细胞增殖GZ2002株,出现典型细胞病变后收集感染细胞及病毒液提取R NA。根据5株登革病毒1型标准株AY145123、FJ176780、FJ176779、DVU88536、EF025110全序列设计6对相互覆盖的引物。采用R T-PCR法扩增覆盖GZ2002株基因组全长的6个cDNA片段,并将其分别克隆到pMD-18T载体上,通过序列测定和重叠序列拼接获得全基因组序列。结果 GZ2002株基因组全长10 735 nt,单一阅读框长10 176 nt,推测编码3 392个氨基酸,5'及3'-UTR分别为94 nt和462 nt,无显著的密码子偏嗜性。GenBank登录号:JN205310。系统进化分析显示GZ2002株属于DENV-1型基因IV型。比较不同致病性的DENV-1型毒株发现,随DENV毒株致病力的增强,编码区氨基酸突变位点明显增多。GZ2002株、泰国16007株、柬埔寨株及印度尼西亚98901530株的5'-UTR二级结构高度保守,3'-UTR分析显示强毒力泰国16007株与柬埔寨株均存在高突变区。结论 GZ2002株属于DENV-1型基因IV型,可能与1998年印度尼西亚DENV-1流行株相关,编码区株特有氨基酸变异位点及3'-UTR高突变区的生物学意义值得进一步探讨。
- 方昕胡珍张俊磊朱军民陈炜尚伟龙袁文常程航黎庶胡晓梅饶贤才
- 关键词：全基因组测序
- 重庆地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌主要流行克隆更替的机制研究被引量：1
- 2014年
- 目的探讨重庆地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株ST239-MRSA-Ⅲ-t030替代ST239-MRSA-Ⅲ-t037克隆的机制。方法选择重庆地区分离的ST239-MRSA-Ⅲ-t030和ST239-MRSA-Ⅲ-t037临床株,检测各菌株的生长曲线,观察菌落形态,分析菌株的药物敏感谱;再通过体外、体内竞争实验和交叉抑制实验深入探讨ST239-MRSA-Ⅲ-t030替代ST239-MRSA-Ⅲ-t037的机制。结果 ST239-MRSA-Ⅲ-t030菌株较ST239-MRSA-Ⅲ-t037有更短的生长迟缓期,后者在固体培养基上生长的菌落相对较小,且都对复方新诺明耐药,对利福平敏感,这与ST239-MRSA-Ⅲ-t030菌株不同(大多数对复方新诺明敏感,对利福平都耐药)。ST239-MRSA-Ⅲ-t030菌株在体外和体内都表现出比ST239-MRSA-Ⅲ-t037菌株更强的生存竞争优势,但两克隆的菌株间并不存在明显的交叉抑制现象。结论 ST239-MRSA-Ⅲ-t030克隆的生存竞争优势和独特的耐药表型可能是其成功替代ST239-MRSA-Ⅲ-t037而成为第一流行克隆的原因。
- 尚伟龙胡启文胡珍朱军民杨杰袁文常程航袁吉振张霞饶青饶贤才
- 关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌利福平耐药
- 登革病毒感染人原代树突状细胞(CD209,-139A/-336A)模型的建立被引量：1
- 2017年
- 目的建立以人原代树突状细胞(dendritic cells,DCs)为宿主的登革病毒(dengue virus,DENV)感染模型。方法采集基因型为CD209,-139A/-336A的人抗凝血标本,分离获得DCs前体细胞,利用rh GM-CSF及rh IL-4诱导,获得未成熟DCs。瑞氏染色鉴定DCs的形态,流式细胞术鉴定DCs的分化效率,淋巴细胞增殖实验鉴定DCs的生物学功能。以I型登革病毒GZ2002株为模式病毒进行病毒感染实验,建立并评估以人原代DCs为宿主的登革病毒感染模型。结果分离获得的DCs前体细胞经细胞因子刺激后成功分化为未成熟DCs,分化效率高达90%。获得的DCs具有典型的细胞形态及生物学功能,可有效刺激淋巴细胞增殖。登革病毒GZ2002株能成功感染诱导获得的原代DCs,促进DCs成熟,并复制产生感染性子代病毒,证明细胞感染模型成功建立。结论成功建立以DCs为宿主的登革病毒感染模型。
- 杨裔方昕胡珍杨杰袁吉振尚伟龙饶贤才
- 关键词：登革病毒树突状细胞细胞模型
- 登革-日本脑炎嵌合病毒样颗粒的设计与构建被引量：2
- 2011年
- 目的设计构建登革-日本脑炎嵌合蛋白表达载体,制备嵌合病毒样颗粒。方法 根据登革病毒样颗粒的形成机制及日本脑炎病毒中和性抗原表位的分布,设计并构建登革-日本脑炎嵌合蛋白表达载体,转染BHK-21细胞,筛选能表达目标蛋白的G418抗性克隆,收集细胞培养上清,纯化病毒样颗粒,用Western-blot和电镜检测病毒样颗粒的形成。结果用RT-PCR扩增、酶切和连接等分子生物学方法成功构建了序列及阅读框均正确的重组表达质粒pCI-SMEJ-14#;将该质粒转染BHK-21细胞,经0.6 g/LG418筛选获得4个能表达目标嵌合蛋白的克隆,从培养的细胞上清中能纯化出直径30~100 nm的病毒样颗粒。结论 所设计的登革-日本脑炎病毒嵌合蛋白能在BHK-21细胞中产生病毒样颗粒,为制备新一代登革-日本脑炎嵌合型疫苗奠定了良好基础。
- 胡珍尚伟龙张俊磊朱军民杨杰刘佳方昕袁文常程航胡晓梅饶贤才
- 关键词：登革病毒日本脑炎病毒病毒样颗粒
