安峰
- 作品数：8 被引量：13H指数：2
- 供职机构：第二军医大学长征医院更多>>
- 发文基金：上海市科学技术委员会资助项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学政治法律化学工程更多>>
- 人源抗-HBs Fab优化表达条件的初步探讨被引量：2
- 2003年
- 目的 利用含重组质粒pBAD/HBsFab的Top10大肠杆菌 ,优化表达人源抗 HBsFab。方法 选取含pBAD/HBsFab载体的Top10大肠杆菌单个克隆分级培养 ,将制备的二级种子液接种于摇瓶和KLF2 0 0 0发酵罐中 ,摇瓶培养表达采用不同的菌体诱导起始密度、诱导剂浓度、诱导表达温度和诱导表达时间。发酵罐培养表达采用不同的培养基和菌体诱导起始密度。诱导表达完毕后 ,纯化蛋白 ,比较表达量 ,并鉴定所获蛋白的抗原性和生物学活性。结果 用摇瓶优化表达后 ,Fab蛋白占菌体总蛋白的 6 % ,为 0 .8mg/g菌体 ,利用发酵培养可进一步增加菌量 ,使蛋白表达量达 80mg/L。所获蛋白经鉴定显示有较好的生物学活性。结论 用重组质粒pBAD/HBsFab ,Top10表达系统 ,可得到 80mg/L的具有较好生物学活性的人源抗 HBsFab蛋白 。
- 安峰陈玉川姜小华韩焕兴
- 关键词：抗体治疗基因工程
- 大肠杆菌发酵生产重组人源抗-HBs Fab
- 2003年
- 在KLF2 0 0 0发酵罐中利用补料分批培养技术培养表达含重组质粒pBAD HBsFab的TOP10大肠杆菌 ,生产人源抗 HBsFab ,为批量生产作准备。在发酵过程中 ,控制溶氧 30 %以上 ,温度 37℃ ,在基础培养基内生长 4h后 ,补加以甘油为碳源的补料 ,继续生长到 9h ,加入阿拉伯糖 ,至终浓度为 0 0 2 % ,30℃诱导表达 5h ,收集菌体 ,纯化制备目的蛋白。利用Westernblot方法检测Fab抗原性 ,Dotblot方法检测生物学活性。 14h发酵结束后 ,菌体密度最终达 96g L ,纯化所得蛋白大约占菌体总蛋白的 6 % ,含量为 80mg L。以重组质粒pBAD HBsFab ,大肠杆菌TOP10表达生产的人源抗 HBsFab为可溶性具生物学活性的蛋白 ,与包涵体表达相比避免了变性、复性这一复杂过程 ,发酵罐表达比率与摇瓶相比没有降低 ,表达量达 80mg L左右 ,为大批量生产作了准备。
- 安峰陈玉川范列英韩焕兴
- 关键词：大肠杆菌发酵生产FAB人源化抗体
- 羊水栓塞的法医学研究
- 该研究旨在:①选择粘膜型肥大细胞系RBL-2H3为研究对象,观察在羊水抗原的刺激下细胞的组胺释放,以及相关的形态学改变,试图在细胞水平证明羊水可以直接导致肥大细胞发生脱颗粒反应,为羊水栓塞的过敏机制提供一定的实验依据.②...
- 安峰
- 关键词：羊水栓塞肥大细胞粘蛋白基因工程抗体
- 文献传递
- 生物工程技术制备人源抗-HBs Fab片段被引量：6
- 2003年
- 目的:用生物工程技术制备人源性抗-HBs F-ah。方法:将从抗体文库中筛选出的人源抗-HBs Fab基因克隆人pBAD/gⅢA载体,进而转化Top10大肠杆菌。对重组质粒菌发酵表达后,利用Ni-NTA-Agarose螯合层析柱纯化周质腔可溶性Fab 蛋白。对所得包涵体依次变性、溶解、纯化后,利用透析进行复性。用Western blot检测Fab蛋白的特异性,Dot blot测定其生物学活性。结果:经Ni-NTA-Agarose柱纯化的周质腔可溶性Fab蛋白,有较好的生物学活性,并且总量达到80mg/L。对所获包涵体进行透析复性后,也可得到少量有活性的蛋白,但比例很小。结论:用pBAD/gⅢA-Top10表达系统表达人源抗-HBs Fab片段,发酵培养后,经有效纯化可得到生物学活性较好的可溶性蛋白,为人源抗-HBs Fab片段的大量制备提供了有效手段。
- 安峰陈玉川陆慧琦韩焕兴
- 关键词：FAB片段生物工程技术
- 生物工程人源抗-HBsFab的抗原特异亲合力简易测定被引量：1
- 2003年
- 目的 建立一种简易的抗体亲合力测定技术 ,对生物工程抗 HBsFab进行抗原特异亲合力测定。方法 应用异种抗体竞争抑制法 ,在硝酸纤维素膜上进行不同抗原浓度、不同抗体抑制浓度的抗原、抗体反应。酶标记抗Fab抗体 (Fabspecific)与相应底物显色 ,通过抑制效果估测靶抗体的亲合力。结果 ①抗 HBsFab组对不同浓度的抗原皆为阳性且能显示浓度差。②鼠腹水单克隆抗 HBs在 1 0倍于人源抗 HBsFab范围内无抑制作用 ;多克隆羊抗 HBsAg在 1 0倍于人源抗 HBsFab时显示抑制效应 ,而在同倍和 1 / 1 0浓度时无抑制作用。结论 本研究建立的是一种简易、实用的方法 ,能够达到直观。
- 韩焕兴陆慧琦安峰叶伟民范列英朱烨曾万杰罗荣城
- 关键词：生物工程免疫印迹
- 三种方法纯化生物工程抗体片段的比较
- 2003年
- 比较 3种不同纯化体系纯化生物工程抗 HBsFab的效率和效果 ,寻求高效、经济的生物工程产品批量纯化方法。采用增菌发酵抗 HBsFab阳性克隆 ,超声破菌法制备Fab上清。分别缓冲平衡抗Fab Sepharose亲合胶、链球菌蛋白G ( prot.G) Sepharose胶和Ni NTA离子螯合胶 ,对Fab上清进行过柱纯化。紫外光检测目的蛋白得率 ,SDS PAGE鉴定产物的纯度并用HBsAg包被ELISA检测其生物活性。结果显示 ,等容积不同类别的胶体对目的蛋白的纯化效率依次为 :Ni NTA离子螯合胶 >prot G Sepharose胶 >抗 Fab Sepharose亲合胶 ;在各胶体饱和结合能力之内 ,3种方法皆可获高纯度产品 ,在SDS PAGE中呈现单一区带 ;HBsAg包被ELISA检测结果为 3种方法纯化制备的Fab在抗原结合能力上未显示明显差别。提示 ,3种纯化方法各有优势和应用限制 ,Ni NTA法在经济性。
- 韩焕兴陆慧琦姜波安峰叶伟民曾万杰罗荣城
- 关键词：SDS-PAGE
- 大鼠羊水与RBL-2H3肥大细胞共培养后脱颗粒的检测被引量：4
- 2003年
- [目的]探讨大鼠羊水与 RBL-2H3肥大细胞共培养后是否有脱颗粒现象发生。[方法]取大鼠不同稀释度的羊水与大鼠来源的RBL-2H3肥大细胞系共培养,用酶联免疫法测定不同时间样品上清的组胺、自发释放的组胺和总组胺,计算组胺释放率。对细胞用阿利新蓝染色,计算脱颗粒指数。用流式细胞仪测定RBL-2H3细胞Annexin Ⅴ标记后的阳性细胞率。[结果]与不同稀释度的羊水共培养后,细胞的组胺释放率有显著差异,组胺的释放和羊水浓度正相关。阿利新蓝染色后计算的脱颗粒指数与组胺释放率测定结果一致。细胞Annexin Ⅴ标记后的阳性率在羊水刺激后明显上升,进一步证明了脱颗粒的发生。[结论]羊水中的物质可以通过直接作用导致RBL-2H3肥大细胞脱颗粒,为羊水栓塞时肥大细胞脱颗粒机制的研究提供了一定的实验依据。
- 安峰陈玉川郭薇
- 关键词：羊水细胞脱颗粒组胺羊水栓塞酶联免疫法
- 人源抗-HBs Fab与IFN-α融合蛋白的克隆与原核表达
- 2004年
- 目的:构建人源单克隆抗-HBs Fab-IFN-α表达载体,探讨该融合蛋白原核表达的可行性及其生物学活性。方法:用PCR体外扩增目的基因IFN-α,单酶点插入已含人源抗-HBs Fab基因的载体,插入点位于轻链基因3′未端。利用酶切、PCR鉴定筛选正确插入的阳性克隆,转化大肠杆菌,挑选单克隆表达、纯化目的蛋自,用ELISA 方法检测融合蛋白IFN-α的抗原性及其抗体亲和性,用WISH细胞检测IFN-α生物学活性。结果:利用插入了人源抗-HBs Fab基因及IFN-α基因的pBAD／gⅢA原核表达系统,成功表达了具生物活性的λ轻链与IFN-α的融合蛋白,其既具有与抗-HBs Fab相近的HBsAg的亲和力,又具有干扰素的活性。结论:λ轻链与IFN-α融合蛋白的成功表达表明,应用原核系统能够同时表达某些特异抗体和其介导的部分生物活性因子,是一种经济、有效的方法,为特异抗体及其介导融合蛋白的制备和临床应用提供了线索。
- 陆慧琦韩焕兴安峰叶伟民曾万杰薛菖
- 关键词：干扰素Α融合蛋白
