李亚娟
- 作品数：12 被引量：17H指数：2
- 供职机构：重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 重组腺病毒Ad5-hSH2抑制Bcr-AbI Y177磷酸化对白血病K562细胞增殖的影响
- ＜正＞目的:具有强烈激活酪氨酸激酶活性的Bcr-Abl融合蛋白可异常激活其下游RAS-MAPK、PI3K-AKT等多条细胞信号转导途径,导致血细胞的恶性转化。本课题构建并鉴定与Bcr-Abl Y177磷酸化位点相关的SH...
- 李亚娟王海霞史静彭智罗红伟罗秋平冯文莉
- 文献传递
- 重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP及其突变体的构建与鉴定被引量：10
- 2011年
- 目的构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HA标签的SH2基因重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP及其突变体Ad5-hSH2mt-EGFP,并观察其对K562细胞增殖的影响。方法设计并化学合成引物,采用RT-PCR法扩增hSH2基因,重叠PCR法扩增hSH2mt基因,分别克隆至pAdTrack-CMV,构建穿梭质粒,经PmeⅠ酶切,转化感受态pAdEasy-BJ5183,在细菌内同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGPF和pAd5-hSH2mt-EGPF,PacⅠ酶切后转染AD293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,扩增病毒,测定滴度并经PCR和Western blot鉴定。重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测病毒对K562细胞增殖活性的影响。结果重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGFP和pAd5-hSH2mt-EGFP经酶切鉴定构建正确;重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP的滴度均可达1.6×1012;PCR结果表明,2种重组腺病毒包装和扩增成功,Western blot结果表明,重组腺病毒携带的目的基因能够在AD293细胞中表达;MTT检测证实,Ad5-hSH2-EGFP对K562细胞的增殖具有明显的抑制作用。结论已成功构建重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,Ad5-hSH2-EGFP能在体外明显抑制K562细胞的增殖,为进一步探讨SH2基因对慢性粒细胞白血病的治疗作用及其机制奠定了基础。
- 史静彭智罗红伟曹唯希陶崑李亚娟王海霞冯文莉
- 关键词：重组腺病毒K562细胞细胞增殖
- 携SH2-Caspase8融合基因重组腺病毒的构建及对K562细胞增殖的影响被引量：2
- 2011年
- 目的构建并鉴定携SH2-Caspase8融合基因的重组腺病毒AdE-SC-EGFP及其突变体,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法采用RT-PCR、重叠PCR扩增SH2-Caspase8融合基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdT-SC-EGFP,进行酶切和测序鉴定。将PmeⅠ酶切后的穿梭质粒转化pAdEasy-BJ5183感受态,通过细菌内同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒质粒pAdE-SC-EGFP及其突变体,PacⅠ酶切后将其转染AD293细胞进行包装,PCR和Western blot鉴定重组腺病毒AdE-SC-EGFP,验证后扩增病毒并测定滴度。结果 PCR检测、酶切和测序结果均表明腺病毒穿梭质粒pAdT-SC-EGFP和重组腺病毒质粒pAdE-SC-EGFP构建成功;PCR检测、EGFP表达检测结果证明重组腺病毒AdE-SC-EGFP包装成功,扩增后,滴度可达1.5×1012pfu/ml。感染K562细胞后,Western blot检测目的蛋白的表达,MTT和半固体集落形成实验检测其对K562细胞生长增殖的影响。结论成功构建并鉴定了携带SH2-Caspase8融合基因的重组腺病毒AdE-SC-EGFP及其突变体;MTT和克隆形成实验证明重组腺病毒AdE-SC-EGFP对BCR-ABL阳性的K562细胞有明显的增殖抑制作用。
- 刘双凤胡晶曹唯希史静彭智王海霞李亚娟冯文莉
- 关键词：细胞增殖SH2CASPASE8重组腺病毒K562细胞BCR-ABL
- 重组蛋白转导域-寡聚化域-血凝素融合蛋白抑制慢性粒细胞白血病BaF3-P210细胞小鼠致瘤能力
- 2011年
- 目的:探讨重组蛋白转导域-寡聚化域-血凝素(protein transduction domain-oligomerization domain-hemagglutinin,PTD-OD-HA)对慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)BaF3-P210细胞小鼠致瘤能力的影响。方法:将BaF3-P210细胞和经40μmol/L PTD-OD-HA处理48h的BaF3-P210细胞分别经尾静脉注射入BALB/c小鼠体内,观察小鼠一般状况以及生存时间,计数外周血白细胞,外周血和骨髓涂片进行Wright-Giemsa染色,肝、脾和肺等各主要脏器组织进行HE染色,蛋白质印迹法检测小鼠骨髓细胞bcr/abl蛋白的表达。结果:BaF3-P210细胞组和经PTD-OD-HA处理的BaF3-P210细胞组小鼠CML发病率分别为90%(9/10)和80%(8/10),外周血白细胞计数分别为(44.3±4.8)×109/L和(20.6±3.2)×109/L(P<0.05),骨髓细胞中bcr/abl癌蛋白表达量分别为5.13±0.46和1.32±0.29(P<0.05),平均生存期分别为(101.3±6.2)d和(185.4±8.7)d(P<0.05)。Wright-Giemsa染色可见,经PTD-OD-HA处理的BaF3-P210细胞组小鼠骨髓、肝脏和脾脏中的白血病细胞浸润程度比BaF3-P210细胞组下降。结论:经PTD-OD-HA处理后的BaF3-P210细胞在BALB/c小鼠体内的致白血病潜能明显受到抑制。
- 季茂胜黄峥兰李亚娟黄世峰曾建明刘钉宾曹唯希冯文莉
- 关键词：融合蛋白质类
- 靶向G偶联蛋白受体87基因shRNA重组表达质粒的构建及鉴定
- 2014年
- 目的构建靶向G偶联蛋白受体(G protein-coupled receptor,GPR)87基因的shRNA重组表达质粒,并进行鉴定。方法根据NCBI基因数据库中的GPR87基因mRNA序列设计并合成3对靶向GPR87基因的shRNA,同时设阴性对照GPR87-HK序列,分别与线性化质粒pGenesil-1.1连接,构建靶向GPR87基因的shRNA重组表达质粒GPR87-1、GPR87-2、GPR87-3及GPR87-HK,在Lipofectamine 2000介导下,分别转染BIU87膀胱癌细胞,通过RTPCR和Western blot法检测各组细胞中GPR87基因mRNA转录和蛋白表达水平,并计算表达抑制率。结果 3种重组质粒经单酶切及测序鉴定,证明构建正确;转染BIU87膀胱癌细胞48 h后,镜下观察均可见绿色荧光;GPR87-1组、GPR87-2组和GPR87-3组细胞中GPR87基因和蛋白表达水平均显著低于GPR87-HK组(P<0.01),mRNA表达抑制率分别为76%、52%和50%,蛋白表达抑制率分别为90%、45%和41%。结论成功构建了靶向GPR87基因的shRNA重组表达质粒,为后续研究GPR87基因对膀胱癌细胞的增殖、凋亡及耐药的影响奠定了基础。
- 鲁力文李亚娟李会王方钟梁冯文莉
- 关键词：RNA干扰膀胱癌
- PTD-OD-HA融合蛋白对BALB/c裸鼠皮下K562细胞实体瘤的治疗作用被引量：1
- 2011年
- 目的观察PTD-OD-HA融合蛋白对BALB/c裸鼠皮下K562细胞实体瘤的治疗作用。方法采用皮下注射K562细胞的方法建立裸鼠皮下实体瘤模型,每两天向实体瘤中间部位多点注射200μl浓度为10 mg/ml的PTD-OD-HA融合蛋白,观察裸鼠瘤体生长情况;HE染色观察肿瘤组织病理学变化;TUNEL法和透射电镜观察肿瘤组织细胞的凋亡。结果经PTD-OD-HA治疗的肿瘤体积明显缩小;肿瘤组织切片经HE染色可见细胞核浓缩和细胞染色加深;TUNEL法和透射电镜检测可见肿瘤细胞发生了凋亡的改变。结论在BALB/c裸鼠体内,PTD-OD-HA融合蛋白具有抑制K562细胞增殖和促进其凋亡的作用。
- 季茂胜黄峥兰李亚娟黄世峰曾建明刘钉宾曹唯希冯文莉
- 关键词：融合蛋白BCR/ABL融合基因
- 融合蛋白TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA的原核表达、纯化及其生物学活性
- 2014年
- 目的原核表达、纯化融合蛋白TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA,并检测其生物学活性。方法以pET32a(+)CTP-OD-HA为模板,PCR扩增OD序列中的第1-87 bp和第190-216 bp序列,并通过重叠PCR连接成为新序列,命名为OD1,克隆至pET32a(+)载体,构建原核表达质粒pET32a(+)CTP-OD1-HA;再分别以pET32a(+)CTP-OD-HA和pET32a(+)CTP-OD1-HA质粒为模板,PCR扩增CTP-OD-HA和CTP-OD1-HA片段,分别克隆至表达载体pCOLDTF-DNA,构建质粒pCOLD-TF-CTP-OD-HA和pCOLD-TF-CTP-OD1-HA,转化E.coli BL21,IPTG诱导表达TF-CTPOD-HA和TF-CTP-OD1-HA融合蛋白;表达的融合蛋白经镍离子亲和层析纯化和脱盐浓缩后,采用MTT法和DAPI染色检测两种融合蛋白对K562细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用。结果重组原核表达质粒pCOLD-TF-CTP-OD-HA和pCOLD-TF-CTP-OD1-HA经菌落PCR及测序证实构建正确;表达的TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA融合蛋白相对分子质量分别约为67 000和63 000,主要为可溶性表达,表达量分别占总菌体蛋白的35%和20%,脱盐浓缩后,纯度分别约为98%和95%,均可与鼠抗HA单克隆抗体特异性结合;TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA对K562细胞的增殖抑制率分别为34%和31%,与PBS对照组比较,差异有统计学意义(P<0.001);TF-CTP-OD-HA和TFCTP-OD1-HA处理的K562细胞胞核均具有细胞凋亡的典型特征。结论原核表达并纯化了TF-CTP-OD1-HA融合蛋白,该蛋白具有与TF-CTP-OD-HA相似的生物学活性,为今后开发治疗慢性粒细胞白血病的小分子多肽药物提供了新的策略。
- 王海霞肖恒陶崑钟梁李亚娟黄世峰冯文莉
- 关键词：融合蛋白纯化生物学活性
- LY294002对CML急变期细胞中Wnt/β-catenin信号通路的影响及其效应
- 2014年
- β-catenin在慢性粒细胞白血病急变过程中发挥着重要作用,而其受BCR/ABL及其下游信号通路调控的具体分子机制尚未完全阐明。该研究旨在探讨PI3K-AKT信号通路对慢粒急变期细胞的影响及其对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。采用PI3K-AKT信号通路的靶向抑制剂LY294002作用于慢粒急变期K562细胞,MTT法检测其对细胞增殖的影响,甲基纤维素克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力,Western blot检测pAKT(Thr308)的表达变化,RT-PCR和Western blot分别检测β-catenin及其下游靶基因c-myc、cyclinD1的mRNA和蛋白表达情况。结果显示,10,20,40μmol/L的LY294002作用细胞24 h后,抑制了K562细胞的增殖以及克隆形成能力,该效应呈浓度依赖的方式。3种浓度的LY294002处理细胞后,PI3K-AKT信号通路明显被抑制,pAKT(Thr308)的蛋白表达明显减少;β-catenin的mRNA表达无明显改变,但其蛋白水平依次减少;β-catenin的下游靶基因c-myc、cyclinD1的mRNA和蛋白水平均明显降低。综上所述,抑制PI3K-AKT信号通路可抑制白血病K562细胞的增殖和克隆形成能力,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路相关。
- 刘张玲胡晶黄峥兰李会李亚娟冯文莉
- 关键词：BCRABL
- 稳定表达BCR/ABL-T315I的小鼠BP210-T315I细胞株的建立
- 2011年
- 目的构建能稳定表达T315I的BCR/ABL的小鼠BP210-T315I细胞株,并观察该细胞株对酪氨酸激酶抑制剂STI571的敏感性。方法采用PCR法将重组逆转录病毒载体MIGR-P210中的abl基因第944位碱基C定点突变为T,再将该位点突变成功的逆转录病毒载体转染到包装细胞内,收集病毒,感染BaF3细胞,经筛选和亚克隆获得稳定表达T315I的BCR/ABL蛋白的小鼠BP210-T315I细胞。采用RT-PCR、DNA测序和Western blot鉴定abl基因第944位碱基是否发生突变;MTT法检测BP210-T315I细胞对STI571的耐药性。结果 T315I的bcr/abl基因已整合到BaF3细胞基因组中,B210-T315I细胞能稳定表达T315I的bcr/abl基因与蛋白;与BaF3-P210细胞株相比,经STI571处理后,BP210-T315I细胞对STI571明显耐药,其耐药倍数约为100。结论已成功构建稳定表达小鼠T315I的转化细胞株,该细胞株具有对STI571耐药的恶性表型特征。
- 王海霞刘钉宾彭智李亚娟黄世峰罗红伟史梦冯文莉
- 关键词：耐药
- 抗CML单链免疫毒素载体的构建、表达及活性鉴定被引量：2
- 2013年
- 目的:构建单链免疫毒素hscFv-ETA'的原核表达载体,经表达后鉴定其对CML细胞的特异性杀伤作用。方法:采用亚克隆技术,首先将hscFv与截短的假单胞菌外毒素基因ETA'通过酶切及连接反应,在载体pWW20上构建hscFvETA'单链免疫毒素基因;再将其亚克隆入pET32a(+)原核表达载体中,转化BL21(DH3)宿主菌,IPTG诱导表达;SDS-PAGE观察其表达水平并建立目的蛋白的纯化方法,Western blot鉴定纯化的目的蛋白,FCM鉴定融合蛋白hscFv-ETA'与细胞结合的活性以及诱导细胞凋亡的能力。结果:限制性酶切图谱和序列分析证实,在pET32a(+)原核表达载体上成功地构建了hscFvETA'单链免疫毒素载体;该基因在pET32a(+)载体中获得高效表达,表达产物的相对分子质量与预期值相符;经Western blot鉴定证实纯化后的重组免疫毒素hscFv-ETA'融合蛋白是正确的;经FCM证实hscFv-ETA'蛋白能特异性结合CML细胞并诱导细胞凋亡。结论:已成功构建并原核表达单链免疫毒素hscFv-ETA',证明该蛋白能发挥特异性结合并诱导CML细胞凋亡。
- 朱小影陶崑李身锋张利军李亚娟王东钟梁冯文莉
- 关键词：慢性粒细胞白血病重组免疫毒素
