徐坤
- 作品数：53 被引量：35H指数：3
- 供职机构：西北农林科技大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金陕西省自然科学基金国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学轻工技术与工程更多>>
- 一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法
- 本发明主要属于高等生物体基因组编辑技术领域，具体涉及一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法。所述方法基于T7 RNA聚合酶和T7启动子的高度特异性识别原理，首先构建T7启动子‑sgRNA...
- 张智英邢佳妮闫强徐坤
- 文献传递
- 鲤春病毒(SVCV)糖蛋白基因的原核表达被引量：1
- 2018年
- 通过将鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)糖蛋白(Glycoprotein,G)基因截短后构建重组表达载体,实现体外高效表达G蛋白,为有关原核诱导蛋白提供参考。以质粒pEGFP-G为模板设计引物,分别扩增G基因的不同片段,与密码子优化后的G基因分别插入pET-32a表达载体,构建重组表达载体pET-32a-GX和pET-32a-OG。经过鉴定后,将重组质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3),通过适宜条件的诱导表达,获得诱导产物并进行SDS-PAGE和Western blotting检测。构建了重组表达载体pET-32a-GX与含密码子优化后G基因的重组表达载体pET-32a-OG;经适宜条件诱导表达了G蛋白后的SDS-PAGE和Western Blotting检测,表明G蛋白成功表达,且含截短片段的重组载体pET-32a-G2的蛋白表达量最高,与原G序列有相同的免疫原性。成功构建截短后的原核表达载体pET-32aGX与密码子优化后的重组表达载体pET-32a-GX,并实现体外大量诱导SVCV的G蛋白。
- 吕慧娇康路路张萌闫娜娜张经纬高文昌徐坤张智英
- 关键词：鲤春病毒血症病毒原核表达
- 一种新型提高HDR效率的 CRISPR/Cas9-Gal4BD 供体适配基因编辑系统被引量：3
- 2022年
- 近年来,CRISPR基因编辑及衍生技术迅速发展,在生命科学、生物医学研究以及动植物育种领域得到了广泛应用。基于DNA双链断裂(double-stranded break,DSB)同源指导修复(homology-directed repair,HDR)机制的基因敲入和点编辑是基因编辑的重要策略,但效率偏低亟待提高。本文提出了驱动供体DNA富集至DSB处以提高HDR效率的新策略,并设计了一套CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统(donor adapting system,DAS)。该系统主要利用Gal4 DNA结合域(Gal4 binding domain,Gal4BD)作为配体蛋白与Cas9融合表达,将Gal4BD结合序列(Gal4 binding sequence,Gal4BS)作为受体序列与双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体结合,以期提高HDR效率。使用HEK293T-HDR.GFP报告细胞系的初步研究结果表明当dsDNA供体同源臂在一定长度(100~60 bp)时该系统能够提高HDR效率2~4倍。进一步的优化研究表明,融合端口和融合使用连接子(linker)的选择会影响Cas9表达效果及活性,而GGS5作为Cas9-Gal4BD融合的连接子则影响较小。同时,本研究还发现Gal4BS-dsDNA供体的差异化设计也会影响HDR效率,将Gal4BS添加到dsDNA供体5′-端的效果最佳。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS在AAVS1和EMX1位点上实现了HDR编辑效率的提高,为进一步利用该系统进行动物分子设计育种研究提供了参考和借鉴。
- 张潇筠徐坤沈俊岑穆璐钱泓润崔婕妤马宝霞陈知龙张智英魏泽辉
- 大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA与orfC重组腺病毒的制备及应用
- 2012年
- 【目的】扩增大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC,制备orfA和orfC重组腺病毒,并感染Hela229和SPC-A-1细胞,以检测orfA和orfC对肿瘤细胞的影响。【方法】从pWDSV全长表达载体中扩增WDSV辅助基因orfA和orfC,构建orfA和orfC基因的重组腺病毒载体以及对照空载体,采用脂质体介导法转染HEK293细胞进行包装和扩增,用绿色荧光蛋白法测定重组腺病毒的滴度;将重组腺病毒转染肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1,采用Weastern Blot方法检测基因orfA和orfC的表达情况,并用MTT法检测其对肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1的影响。【结果】PCR扩增获得了891bp的orfA基因和360bp的orfC基因,成功构建了对照空载体pAdEasy-l-CK和含有orfA和orfC基因的腺病毒载体pAdEasy-l-orfA和pAdEasy-l-orfC,转染HEK293细胞并进行包装后获得了重组腺病毒Ad-CK、Ad-orfA和Ad-orfC,用Hela229细胞测得其滴度分别为5.67×109,2.00×109和7.33×108 GFU/mL。重组腺病毒对肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1的生长具有抑制作用。【结论】初步证明了orfA和orfC基因对人类肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1的生长具有抑制作用,为进一步研究WDSV辅助基因对人类肿瘤的影响以及肿瘤萎缩的分子机理奠定了基础。
- 张优优徐坤王亮亮张婷婷辛颖任充华闫强张智英
- 关键词：重组腺病毒肿瘤
- 一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法
- 本发明主要属于基因编辑技术领域，具体涉及一种基因无缝编辑方法。该方法构建靶向CCR5和eGFP的CRISPR/Cas9表达载体CCR5.CRISPR/Cas9和eGFP.CRISPR/Cas9，并构建供体CCR5‑Don...
- 张智英白义春徐坤魏泽辉和林洁任充华邵斯旻吴芸刘中天
- 文献传递
- 源于嗜热链球菌的真核CRISPR/Cas9系统的建立、优化及其应用研究
- 基因组靶向修饰技术对基因功能研究、基因治疗以及转基因育种研究等都具有重要的意义和价值,其中,特异性核酸内切酶的开发是基因组靶向修饰研究中的关键。锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)的发展为基...
- 徐坤
- 关键词：嗜热链球菌核酸酶报告基因
- 大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC多抗的制备及初步应用被引量：2
- 2012年
- 【目的】制备大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC的多克隆抗体,并用其检测酵母和肿瘤细胞中目的蛋白的表达。【方法】以WDSV基因组序列为模板,PCR扩增WDSVorfA和orfC基因,分别构建其原核表达载体,转化Rosseta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白后,采用皮下多点注射结合耳静脉加强免疫的方法免疫新西兰白兔,制备抗orfA和抗orfC的多克隆抗体,用Western blot法检测抗体的特异性。用制备的多克隆抗体检测orfA和orfC融合蛋白在酵母和HeLa299、SPC-A-1肿瘤细胞中的表达。【结果】PCR扩增获得了WDSVorfA和orfC基因。成功构建了orfA和orfC基因的原核表达载体并进行了诱导表达,orfA和orfC重组融合蛋白以包涵体形式存在;采用皮下注射结合耳静脉加强免疫有效地提高了抗体效价,成功制备得到了兔抗orfA和兔抗orfC血清,抗体效价达1∶8 000～1∶10 000;通过Western blot法,利用上述抗血清分别检测到了原核表达的目的蛋白及酵母和肿瘤细胞中表达的目的蛋白。【结论】制备得到的抗orfA和抗orfC多克隆抗体具有很好的特异性,能够用于原核表达、酵母和肿瘤细胞中表达的目的蛋白的Western blot检测。
- 李铎徐坤王亮亮周罡麻丽霞张智英
- 一种增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒的建立
- 本发明公开了增强基因表达的自激活Gal4/UAS系统表达盒的建立，通过优化UAS数目及GAL4激活/结合域类型，找到一种增强效果较好的表达盒，由自身强启动子CMV启动，借助Gal4/UAS系统使转录和翻译效率提高，从而产...
- 徐坤刘玉万张智英闫娜娜雒志新韩宝泉李欣憶张哓兰
- 文献传递
- 基于SSA修复机制和特异性核酸酶活性检测的双荧光报告载体系统的开发及应用被引量：3
- 2015年
- 报告载体系统因构建快捷、改造简单、操作容易、经济有效,并且能通过介导筛选核酸酶阳性细胞富集基因组修饰的阳性细胞克隆,而成为特异性核酸酶活性检测的重要手段。基于非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)修复机制的报告系统在引入DNA双链断裂(Double strand breaks,DSBs)后,经过优化最高也只有2/3的概率实现报告基因的修复;而单链退火(Single strand annealing,SSA)修复机制在引入DSBs后,理论上可以实现报告基因100%的修复,具有更高的灵敏度,有利于活性较低的特异性核酸酶活性的检测,为基因组修饰研究中特异性核酸酶活性的检测提供了有效的手段。本研究设计并构建了3套基于SSA修复机制的双荧光报告载体系统,并应用m RFP-e GFP系统检测了3对ZFNs的有效活性,其活性检测结果分别为8.9%、9.3%和5.0%,该研究为核酸酶活性的检测提供了有效的手段。
- 韩芙蓉王令徐坤张智英王昕
- 用于富集CRISPR/Cas9介导的同源重组修复细胞的筛选报告载体及筛选方法
- 本发明公开了一种用于富集CRISPR/Cas9介导的同源重组修复细胞的筛选报告载体及筛选方法。筛选报告载体包括通用sgRNA表达盒、Cas9表达盒、抗性基因表达盒以及抗性基因同源重组修复模板，筛选报告载体自身可以通过抗性...
- 张智英闫娜娜孙永森徐坤房圆圆邓竞荣穆璐
- 文献传递
