刘喜朋
- 作品数：44 被引量：17H指数：2
- 供职机构：上海交通大学更多>>
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- 相关领域：生物学医药卫生轻工技术与工程农业科学更多>>
- 古菌Pyrococcus furiosus核酸酶RecJ的结构与功能研究
- 易刚顺李敏军何建华肖湘刘喜朋
- 嗜热泉生古菌Aeropyrum pernix寡核酸酶酶学功能研究
- 邓永杰肖湘刘喜朋
- 嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius核酸内切酶V的重组表达与酶学特征
- 2021年
- 【目的】表达纯化嗜酸嗜热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的核酸内切酶V(Saci_0544),对其核酸内切酶活性及酶学特征进行探究。【方法】将Sulfolobus acidocaldarius核酸内切酶V(SacEndoV)在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到目标蛋白;利用带有不同类型损伤的寡核苷酸作为底物,结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,鉴定SacEndoV对相应损伤寡核苷酸底物的剪切活性。【结果】SacEndoV特异性剪切含脱氧肌苷(Deoxyinosine)的损伤DNA底物,明显偏好单链DNA底物。SacEndoV在70–95℃温度范围内酶活性高,酶活性依赖于二价金属离子,Mg^(2+)为最佳辅助离子,其最佳反应pH为7.5–8.0,高于200 mmol/L的NaCl会明显抑制其剪切活性。损伤DNA中脱氧肌苷3′端相邻的脱氧核糖核苷酸的结构完整性对于SacEndoV识别并剪切相应底物具有重要影响,脱氧肌苷3′端无碱基位点的存在使得SacEndoV不能够切断损伤DNA。此外,经测定SacEndoV对于含肌苷的损伤RNA底物具有剪切活性。【结论】本研究证实SacEndoV是一种典型的核酸内切酶V,对含脱氧肌苷的损伤DNA具有特异性的内切酶活性,推测其在Sulfolobus acidocaldarius体内参与脱氧肌苷的切除修复。
- 宋吴涛刘喜朋缪晓玲
- 关键词：嗜热古菌
- 基于dU或dI寡核苷酸探针的单核苷酸多态性检测方法
- 本发明涉及一种基于dU或dI寡核苷酸探针的单核苷酸多态性检测方法。dU或dI寡核苷酸探针序列特征是：全长30-40个核苷酸，5’端第15-25位的一个核苷酸与待检SNP位点配对，3’端第1-15位的一个核苷酸为dU或dI...
- 刘喜朋刘建华
- 文献传递
- 荧光共振能量转移寡核苷酸微阵列的核酸检测方法
- 一种荧光共振能量转移寡核苷酸微阵列的核酸检测方法，将未进行荧光标记的待测核酸样品与寡核苷酸微阵列杂交、洗脱，使能够与寡核苷酸探针完全配对的核酸结合在基因芯片上，寡核苷酸微阵列上寡核苷酸片段的序列特征是5′-末端的序列与待...
- 刘建华刘喜朋陈洁林志新
- 文献传递
- Sulfolobus acidocaldarius DHH超家族核酸酶Saci0542的酶学特征研究
- 2022年
- 【目的】以嗜酸嗜热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius的DHH超家族核酸酶(Saci0542)为例,研究其核酸外切酶活性特点,为阐明其在DNA代谢中的具体功能提供生化基础。【方法】将嗜酸嗜热硫化叶菌DHH超家族核酸酶Saci0542基因在大肠杆菌中重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯的重组蛋白;利用荧光标记的寡核苷酸作为底物,用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,鉴定Saci0542的酶学特征。【结果】重组表达的DHH超家族核酸酶Saci0542具有典型的单链核酸特异性的3ʹ-5ʹ外切酶活性。进一步酶学特征表征结果如下:酶活性依赖于二价金属离子Mn^(2+),而Ca^(2+)、Mg^(2+)、Zn^(2+)等二价金属离子对活性没有明显的促进作用;Saci0542在pH 5.5–10的广泛范围内均表现出较高酶活性;高于200 mmol/L的NaCl强烈抑制酶活性;最适反应温度为50–55°C;末端磷酸基团抑制3ʹ-5ʹ外切酶活性。【结论】本研究证实,Saci0542是一种Mn^(2+)依赖型3ʹ-5ʹ外切酶,酶活性与NrnA核酸酶相似,可能在细胞内负责DNA修复或RNA的降解再循环利用。
- 王伟玮谢娟娟宋吴涛刘喜朋汪启胜
- 关键词：酶学特征
- 基于dI修饰引物和内切核酸酶V的等温PCR核酸扩增方法
- 本发明涉及一种基于dI修饰引物和内切核酸酶V的等温PCR核酸扩增方法，扩增目标核酸的引物与模板完全配对，5＇端第10－30位含有1－5个dI核苷酸，dI核苷酸下游具有10－30个核苷酸。等温PCR反应组分包括dI修饰的正...
- 刘喜朋刘建华
- 文献传递
- 超嗜热古菌Thermococcus eurythermalis A501编码B家族DNA聚合酶的生化特性及PCR应用被引量：2
- 2022年
- DNA聚合酶广泛应用于PCR技术,在生命科学研究及相关领域发挥重要作用。但目前商业化DNA聚合酶仍不能完全满足科研需要,有必要寻求高性能DNA聚合酶。文中克隆表达了超嗜热古菌(Thermococcus eurythermalis)A501来源的B家族DNA聚合酶基因(NCBI数据库基因登录号为TEU_RS04875)、表征该重组蛋白的生化特性、评价了其PCR应用。将删除intein蛋白序列的DNA聚合酶(Teu-PolB)进行体外重组表达,经亲和层析和离子交换层析纯化获得Teu-PolB蛋白;利用5′端带荧光标记的寡核苷酸作为底物,用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定Teu-PolB的生化特性;以噬菌体λDNA基因组为模板,探究Teu-PolB的PCR应用。结果显示,Teu-PolB具有DNA聚合酶活性和3′→5′核酸外切酶活性,该酶在98℃下的半衰期约为2 h,热稳定性高。使用Teu-PolB进行PCR扩增,最适PCR缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,2.5 mmol/L MgCl_(2),60 mmol/L KCl,10 mmol/L(NH_(4))_(2)SO_(4),0.015%Triton X-100和0.01%BSA,最适延伸温度为68℃。此外,Teu-PolB能在2 kb/min条件下成功扩增4 kb目的片段,扩增产量弱于商品化Taq DNA聚合酶,优于Pfu DNA聚合酶,但扩增速率和保真度优于Taq和Pfu DNA聚合酶,且对盐的耐受性较高。综上所述,本研究鉴定了一种高保真DNA聚合酶Teu-PolB的生化特性,结果表明该酶可应用于PCR扩增,具有热稳定性高、耐盐性能好、扩增速率高、保真度高等特征。
- 翁妍刘喜朋
- 关键词：超嗜热古菌DNA聚合酶PCR
- 微生物酶作用机制及其分子设计研究
- 冯雁刘建华杨广宇刘喜朋梁如冰
- 该项目属于生物学领域，微生物生物化学学科。微生物酶高效作用机制及分子设计是生物学领域的热点和前沿课题，不仅能加深课题组对生物体内复杂生物化学反应过程的理解，也有利于构建新功能酶，为新材料、能源及医药等产品的生物制造提供解...
- 关键词：
- 关键词：微生物酶蛋白质工程
- 火球菌Pyrococcus furious瓣状核酸内切酶1的表达纯化及酶学特征
- 2017年
- 【目的】克隆表达和纯化火球菌Pyrococcus furious来源的瓣状核酸内切酶1基因pFEN1(PF1414),对该蛋白的活性和酶学特征进行鉴定和分析。【方法】将pFEN1在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯蛋白;利用人工合成的荧光标记的寡核苷酸片段作为底物,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定pFEN1在体外的酶学特性以及与其他蛋白的相互作用。【结果】pFEN1重组蛋白能在大肠杆菌中进行高效表达;高于100 mmol/L的NaCl会抑制pFEN1的活性;pFEN1的核酸酶活性依赖于金属离子Mg^(2+)或Mn^(2+),且Mn^(2+)的催化效率优于Mg^(2+);来自嗜热古菌的pFEN1是一种耐高温蛋白,最适反应温度为60–65°C;增殖细胞核抗原(PCNA)能促进pFEN1的内切酶活性。【结论】本研究证实pFEN1是一种Mg^(2+)或Mn^(2+)依赖的核酸内切酶,且PCNA能促进该酶的活性。
- 谢娟娟王风平刘喜朋
- 关键词：嗜热古菌
