郝木强
- 作品数：3 被引量：5H指数：1
- 供职机构：北京工业大学生命科学与生物工程学院更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 重组低出血抗凝蛋白在毕赤酵母中的中试发酵工艺研究及其纯化与鉴定被引量：5
- 2013年
- 目的：通过对毕赤酵母中试发酵工艺的改进，建立一种简便可行的重组低出血抗凝蛋白（EH）的中试发酵工艺，为EH蛋白的放大生产研究奠定基础。方法：首先通过摇瓶培养绘测毕赤酵母工程菌的生长曲线，然后根据生长曲线，将对数生长期的菌种经过两级摇瓶培养放大后，直接接种到500L的发酵罐中放大培养，通过发酵液的D_600nm值、溶氧值（D02）及菌体湿重动态监测细菌的生长状态，并用流加甲醇的方法诱导表达目的蛋白；表达上清经超滤、两步离子交换层析纯化获得目的蛋白；用非还原型SDS-PAGE和HPLC检测目的蛋白的纯度；用SDS-PAGE和质谱方法分析目的蛋白的相对分子质量；用Western印迹验证目的蛋白；用凝块法检测目的蛋白的抗凝活性。结果：发酵结束时，上清中蛋白含量达1．41g／L，经后期分离纯化，得到约21gEH蛋白，SDS-PAGE分析可见EH蛋白在还原状态下表观相对分子质量约为13．2×10^3±0．2×10^3，质谱分析相对分子质量约为7.3×10^3±0．73×10^3；Western印迹表明检测条带为目的蛋白，能被抗水蛭素抗体特异性结合；非还原型SDS-PAGE和HPLC测得EH蛋白的纯度均高于95％；凝块法检测EH蛋白的抗凝比活性为512～1024ATU／mg。结论：建立了一条简便可行的EH蛋白的中试放大发酵生产工艺。
- 郝木强李彦英刘春杰王秀冬刘晶晶李艳琪刘洋刘洋吴祖泽
- 关键词：水蛭素重组蛋白毕赤酵母中试放大
- 低出血抗凝蛋白在毕赤酵母中的中试发酵和质量研究
- 通过对毕赤酵母中试发酵工艺的改进，建立一种简便可行的重组低出血抗凝蛋白EH(EPR-Hirudin，简称EH)的中试放大发酵工艺，并对经分离纯化得到的EH蛋白进行了质量检定方法、质量标准、初步稳定性实验等方面的研究，主要...
- 郝木强
- 关键词：水蛭素毕赤酵母
- 利用基因敲除技术缺失毕赤酵母羧肽酶Y基因的初步研究
- 2012年
- 目的通过基因敲除技术缺失毕赤酵母编码的羧肽酶Y(carboxypeptidase Y,CPY)基因cpy,观察其对毕赤酵母生长和外源蛋白表达的影响。方法通过PCR方法扩增出内部含有潮霉素B抗性基因的cpy同源序列;通过电转法将同源序列转入GS115-EH感受态细胞中,并用潮霉素B筛选出阳性克隆。用平板显色法测定阳性克隆菌的羧肽酶活性,同时用PCR法鉴定阳性克隆菌的cpy基因是否缺失。对cpy基因缺失的GS115-EH△cpy菌,分别用YPD和BMGY-BMMY培养研究其生长特性;用BMMY培养基进行甲醇诱导表达外源蛋白,观察其蛋白表达的特性。结果 GS115-EH△cpy的羧肽酶基因cpy被成功敲除,羧肽酶活性丧失。YPD培养条件下,GS115-EH△cpy生长后期的D600明显低于GS115-EH,而用BMMY诱导培养基,GS115-EH△cpy的生长明显改善,但仍然低于对照菌。蛋白电泳结果显示甲醇诱导GS115-EH△cpy的蛋白表达量也低于对照菌。结论 GS115-EH△cpy的cpy基因被成功敲除,在YPD培养条件下,其生长低于对照菌,在BMMY培养条件下,其生长明显改善,但仍然较对照菌差,而且其外源蛋白的表达也低于对照菌。
- 王文文郝木强刘春杰靳继德吴祖泽
- 关键词：毕赤酵母羧肽酶基因敲除
