沈芬平
- 作品数：17 被引量：44H指数：4
- 供职机构：浙江大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划浙江省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 膜表达热休克蛋白70真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞的转染被引量：2
- 2004年
- 目的构建普遍适合性的膜表达热休克蛋白70(HSP70)的真核表达载体,修饰并建立HSP70表达并结合在细胞膜表面的肿瘤细胞。方法RT-PCR法从人胚肾中获取HSP70的cDNA,扩增成带酶切位点的目的基因。选择载体pDisplay,将目的基因插入载体多克隆酶位点中。DNA测序证实后,以脂质体转染的方法,将载体转染到黑色素瘤细胞。用G418抗性筛选获得阳性克隆。结果酶切电泳和DNA测序证实载体构建正确;目的基因的上游带信号肽序列,下游带跨膜序列。RT-PCR产物电泳、WesternBlotting、激光共聚焦显微镜和流式细胞术证实大量HSP70表达并结合在转染的黑色素瘤细胞膜表面。结论成功地构建了膜表达HSP70的真核表达载体;转染到黑色素瘤细胞后,细胞膜表面表达丰富的HSP70。转染细胞可以进一步制备新型瘤苗。
- 黄常新余海杨关根王青青沈芬平李达
- 关键词：HSP70表达转染热休克蛋白70黑色素瘤细胞肿瘤细胞
- 抗人髓系分化标志基因的单克隆抗体及其应用
- 本发明提供抗人髓系分化标志基因的单克隆抗体及其应用。经抗原肽免疫小鼠，收集致敏的小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，利用酶联免疫吸附试验方法判定阳性克隆，建立分泌抗人髓系分化标志基因的单克隆抗体的细胞系，把阳性的细胞扩增...
- 王青青沈建根沈芬平李楠曹雪涛
- 文献传递
- 聚乙烯亚胺转基因影响因素的测定及其优化被引量：15
- 2004年
- 聚乙烯亚胺 (PEI)为阳离子多聚物 ,可浓缩DNA形成纳米级颗粒 ,作为基因释放载体转染真核细胞 .选用Mr2 5 0 0 0 ,分枝状的聚乙烯亚胺转染质粒 ,比较多种转基因效率的影响因素 .通过MTT法测定PEI对COS 7细胞的细胞毒性 .利用电泳阻滞实验测定PEI与DNA形成复合物时所需的比例 .通过PEI转染增强型绿色荧光蛋白的pEGFP质粒、编码β 半乳糖苷酶的pSVβ质粒 ,探索氯喹、白蛋白、血清、盐离子浓度、质粒剂量、细胞数量等对聚乙烯亚胺转基因效率的影响 .实验发现 ,PEI对细胞的毒性作用与剂量相关 .PEI DNA的N P比在 3 0以上方可完全结合DNA .溶酶体抑制剂氯喹可增加转染效率 .培养液中的白蛋白、血清会降低转染效率 .生理盐溶液作为配制PEI DNA复合物的溶媒 ,转染效率高于 5 %葡萄糖作为溶媒 .随着转染质粒剂量的增加 ,转染效率呈剂量依赖正效应 .聚乙烯亚胺是有效的体外真核细胞转染剂 ,可用于合成更复杂的基因释放载体 .
- 李经忠王青青余海沈芬平吴萍萍
- 关键词：聚乙烯亚胺转基因基因治疗
- 超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A锚定的膜表达热休克蛋白70的肠癌瘤苗的抗癌治疗作用研究被引量：2
- 2006年
- 目的研制超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)锚定的膜表达热休克蛋白(HSP)70的肠癌细胞瘤苗,研究其抗肿瘤治疗作用。方法以先期实验制备的膜表达HSP70肠癌细胞株CT26。扩增后以本研究组早先研制的跨膜型SEA蛋白转染法锚定肠癌细胞,灭活并制备双重修饰的肠癌细胞瘤苗。观察瘤苗在体外对小鼠脾淋巴细胞的增殖刺激效应；在BALB/c小鼠结直肠癌移植模型中观察瘤苗的抗癌治疗作用：瘤体生长抑制和荷瘤鼠的生存时间；并同时检测实验鼠的自然杀伤细胞(NK)和细胞毒淋巴细胞(CTL)活性。结果激光共聚焦显微镜和流式细胞术均证明瘤苗细胞的双重修饰：SEA锚定,HSP70表达并结合在瘤苗细胞膜表面。比较对照,SEA锚定或膜表达HSP70的单一修饰瘤苗均显示出较高的鼠淋巴细胞增殖刺激效应；较强的瘤体生长抑制,并使荷瘤鼠的生存时间延长。而SEA锚定的膜表达HSP70的双重修饰瘤苗比单一修饰瘤苗,有着更高的淋巴增殖刺激效应,更强的瘤体生长抑制作用,并使荷瘤鼠的生存时间进一步延长。结论成功研制了超抗原SEA锚定的膜表达HSP70的肠癌细胞瘤苗,此双重修饰瘤苗对结直肠癌荷瘤小鼠有更强的治疗作用。
- 黄常新余海杨关根王青青李达马文学沈芬平
- 关键词：超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A热休克蛋白70瘤苗
- 肿瘤相关抗原RCAS1重组质粒的构建与GST-RCAS1融合蛋白的表达和纯化及鉴定被引量：1
- 2006年
- 目的:构建RCA S1的重组质粒、表达GST-RCA S1融合蛋白并进行纯化和生物学活性鉴定。方法:从M CF-7细胞提取总RNA,通过RT-PCR得到RCA S1的扩增产物,纯化后用E coRⅠ和BamHⅠ双酶切。选择pGEX-2T作为载体,用E coRⅠ和BamHⅠ双酶切后与上述酶切后DNA连接,转化感受态JM 109大肠杆菌,挑单个菌落提取质粒进行双酶切和测序鉴定。选择测序正确的质粒重新转化BL 21大肠杆菌,用终浓度0.1 mm o l/L的IPTG诱导表达GST-RCA S1蛋白,用GST亲和层析纯化并通过SDS-PAGE电泳和W estern印迹试验证实。利用特异性抗RCA S1多抗(N-18和C-20)鉴定所表达的融合蛋白,通过流式细胞仪检测GST-RCA S1融合蛋白诱导活化T细胞凋亡的作用。结果:通过RT-PCR得到大小为642bp的产物,重组质粒通过双酶切和测序鉴定正确。通过IPTG诱导在BL 21大肠杆菌中表达并纯化得到GST-RCA S1蛋白,通过SDS-PAGE电泳鉴定分子量为52 kM r,与预测一致,并由W estern印迹试验证明为GST融合蛋白。该融合蛋白能被特异性抗RCA S1(N-18和C-20)多抗识别。GST-RCA S1对诱导活化的T细胞凋亡有一定的作用。结论:成功构建RCA S1的重组质粒,并表达GST-RCA S1融合蛋白,对其生物学活性作了初步研究。
- 洪学军沈芬平王青青
- 关键词：RCAS1重组质粒
- 膜表达热休克蛋白70的肠癌瘤苗抗肿瘤治疗作用研究被引量：4
- 2005年
- 目的研制膜表达热休克蛋白(HSP)70瘤苗并研究其抗肿瘤治疗作用。方法以膜表达HSP70的真核表达载体pDisplay-mbHSP70转染肠癌细胞株CT26。用G418抗性筛选获得阳性克隆,扩增并制备瘤苗。观察瘤苗在体外对小鼠脾淋巴细胞的增殖刺激效应;在BALB/c小鼠结直肠癌模型中观察瘤苗的抗肿瘤治疗作用;并检测实验鼠的自然杀伤细胞(NK)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果激光共聚焦显微镜和流式细胞术均证明,大量HSP70表达并结合在肠癌瘤苗细胞膜表面。比较对照,胞浆表达HSP70瘤苗显示出较高的鼠淋巴细胞增殖刺激效应,较强的瘤体生长抑制,并使荷瘤鼠的生存时间延长;而膜表达HSP70瘤苗比胞浆表达者有着更高的淋巴增殖刺激效应,更强的瘤体生长抑制作用,并使荷瘤鼠的生存时间进一步延长。结论HSP70表达并结合在细胞膜表面的肠癌细胞瘤苗对结直肠癌CT26荷瘤小鼠有更强的治疗作用。
- 黄常新余海杨关根王青青沈芬平李达曹雪涛
- 关键词：热休克蛋白70膜表达抗肿瘤治疗HSP70表达胞膜表面
- 聚乙烯亚胺载体介导的基因转移被引量：9
- 2004年
- 目的 :探讨以聚乙烯亚胺为骨架的非病毒载体在基因转染中的影响因素。方法 :利用聚乙烯亚胺分别结合含β半乳糖甙酶报告基因的 p SVβ表达质粒 ,含绿色荧光蛋白报告基因的 p EGFP质粒转染 Cos- 7细胞 ,通过组织化学法测定细胞抽提产物中βgal的表达量和流式细胞仪法测定绿色荧光蛋白阳性细胞的表达比例 ,来测定影响转基因效率的各种参数。结果 :在培养液中 ,6 mg/ L聚乙烯亚胺作用 NIH 3T3细胞 2 4 h,细胞生存率为 6 4.2 % ,7mg/ L时细胞生存率为 5 4.4 %。聚乙烯亚胺在 N/ P比 3.0以上方可完全结合 DNA。溶酶体抑制剂氯喹可增加聚乙烯亚胺的转染效率 ;培养液中的白蛋白、血清可降低转染效率。作为配制聚乙烯亚胺 / DNA复合物的溶媒 ,HEPES缓冲液和生理盐水优于 2 78mmol/ L葡萄糖。在配制聚乙烯亚胺 / DNA复合物的溶媒中加入 Mg2 +可降低转染效率。结论 :通过体外细胞试验证明 。
- 李经忠王青青余海沈芬平李达郑轶
- 关键词：聚乙烯亚胺转染
- 非病毒载体聚乙烯亚胺转基因因素的优化被引量：2
- 2005年
- 聚乙烯亚胺属于阳离子多聚物,可浓缩DNA作为转基因非病毒载体。但其转染影响变量较多,如果不能充分控制将不能得到重复的、良好的结果。这里测定了聚乙烯亚胺转基因效率的影响因素,为合成更复杂的人工转基因载体创造条件。我们通过聚乙烯亚胺转染编码β-半乳糖苷酶的pSVβ质粒到CO S-7和N IH 3T 3细胞中,测定质粒因素、血清、细胞密度、操作方式以及转染复合物的保存因素对聚乙烯亚胺转基因效率的影响。结果表明:质粒中生物活性抑制剂明显降低转染效率,通过截流分子量3000或10000的超滤可以除去生活性抑制剂;断裂的质粒降低转染效率;培养液中的血清、白蛋白降低转染效率;细胞密度影响转染效率;PE I/DNA复合物与细胞作用8h后吸去,转染效果最优。冻存显著降低PE I/DNA转染复合物转染效率。聚乙烯亚胺可以作为合成新型非病毒载体的骨架,但必须控制有关因素才能发挥最佳的和可重复性的转染结果。
- 李经忠王青青余海沈芬平马文学易平勇
- 关键词：聚乙烯亚胺基因转染非病毒载体
- 腺病毒介导的LIGHT联合IL-12治疗小鼠转移性乳腺癌及其机制
- 目的:研究腺病毒介导的LIGHT联合IL-12的抗肿瘤作用及其免疫机理探讨,观察其对小鼠4T1乳癌和转移的治疗作用以及长期免疫保护作用。方法:收集对数生长期的4T1细胞,注射至BALB／c小鼠右腹部皮下,建立4T1乳腺癌...
- 赵德矿王青青沈芬平洪学军胡桂莉曹雪涛
- 文献传递
- 腺病毒介导的LIGHT联合IL-12治疗小鼠转移性乳腺癌及其机制
- 【目的】研究腺病毒介导的 LIGHT 联合 IL-12的抗肿瘤作用及其免疫机理探讨, 观察其对小鼠4T1乳癌和转移的治疗作用以及长期免疫保护作用。【方法】收集对数生长期的4T1细胞,注射至 BALB/c 小鼠右腹部皮下,...
- 赵德矿王青青沈芬平洪学军胡桂莉曹雪涛
- 文献传递
