目的:构建人miR-34a的真核表达载体,并研究其对宫颈癌细胞株Caski细胞活性的影响。方法:以人正常组织基因组DNA为模板,用PCR法扩增得到miR-34a的前体序列,构建miR-34a真核表达载体pEGFP-C1-miR34a。同时用重组载体pEGFP-C1-miR34a转染宫颈癌细胞株Caski细胞,筛选miR-34a稳定表达细胞系作为实验组,pEGFP-C1转染组为对照组(Control),用RT-PCR及Real time RT-RCR法鉴定miR-34a在克隆细胞中的表达,并用MTT、FCM分析miR-34a的生物学特性,RT-PCR研究检测其靶基因表达改变。结果:成功构建了人miR-34a真核表达载体pEGFP-C1-miR34a,并在宫颈癌Caski细胞中上调miR-34a的表达,实验组miR-34a的表达相对于对照组升高约3.13倍;MTT提示,实验组miR-34a能够显著的抑制Caski细胞增殖,差异有统计学意义,P=0.018;实验组G0/G1期百分率为77.7%,与对照组的50%比较,差异有统计学意义,P=0.004;而实验组S期百分率为20.3%,对照组为35.4%,两组比较差异有统计学意义,P=0.027;实验组细胞miR-34a靶基因细胞周期基因CDK4、CDK6、Cyclin E2和E2F1mRNA的表达下调,与对照组比较差异有统计学意义,P=0.002。结论:成功构建人miR-34a的真核表达载体,并能显著抑制宫颈癌细胞株Caski细胞活性,为进一步研究miR-34a在宫颈癌中的功能及基因调控机制奠定了实验基础。
