目的:探讨Kindlin-2对小鼠子宫发育及雌鼠生育能力的影响及其作用机制。方法:利用Cdh16-Cre工具鼠和Kindlin-2^(flox/flox)小鼠构建在子宫内膜中特异性敲除Kindlin-2的小鼠模型,观察敲除Kindlin-2对雌鼠子宫内膜发育和生殖力的影响。在子宫内膜癌细胞系HEC-1和Ish中分别进行高表达和敲低Kindlin-2的实验,检测雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的激活变化,并且提取特异性敲除Kindlin-2的雌鼠(实验组,基因型为Cdh16-Cre;Kindlin-2^(flox/flox))和未特异性敲除Kindlin-2的雌鼠(对照组,基因型为Kindlin-2^(flox/flox))子宫蛋白,每组包含6~8只小鼠,重复3次独立实验,检测mTOR信号通路和Hippo信号通路关键分子的蛋白水平。结果:成功构建了子宫内膜特异性敲除Kindlin-2的小鼠模型,通过鼠尾聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、Western blot、免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)等方法鉴定和验证Kindlin-2在小鼠子宫中的敲除效率。子宫内膜特异性敲除Kindlin-2的雌鼠与对照组相比体质量减轻、生殖能力严重受损、出生仔鼠数量减少,但出生仔鼠中雌鼠和雄鼠的比例未发生改变,通过苏木精-伊红染色实验观察表明实验组子宫内膜发育不完整、子宫壁厚度变薄。机制方面,子宫内膜癌细胞系HEC-1和Ish中敲除Kindlin-2能够下调mTOR、磷酸化mTOR、腺嘌呤核糖核苷酸激活蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)、磷酸化的AMPK和磷酸化的核糖体蛋白(ribosomal protein S6,S6)的蛋白水平,在雌鼠子宫中发现特异性敲除Kindlin-2能够上调Mps结合1(Mps one binding 1,MOB1)、磷酸化的Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)的蛋白水平。结论:Kindlin-2通过抑制mTOR信号通路、激活Hippo信号通路抑制子宫内膜的发育,进而抑制雌鼠的生育能力。
目的了解新生期注射己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)对雌性BALB/c小鼠生后不同时期脾细胞凋亡及Bcl-2、Bax的影响。方法新生雌性BALB/c小鼠,在生后24h内颈背部皮下注射DES40μg,每隔24h注射一次,共连续5次,对照组平行注射等量无菌豆油。分别在生后7、14、21、35和49d将小鼠处死,取其脾进行常规石蜡包埋和切片,进行TUNEL(TdT-mediated dUTP nick endlabeling,)检测以及Bcl-2、Bax的免疫组织化学检测。结果与对照组相比,DES组雌性BALB/c小鼠脾细胞的TUNEL阳性细胞数目在生后各点均有显著性增加。Bcl-2在各时间点DES组的表达均弱于相应的对照组。Bax在生后7d的对照组和DES组中的表达差异无统计学意义,而在生后14、21、35和49d DES组的阳性表达明显多于对照组。结论新生期注射DES可以导致雌性BALB/c小鼠脾细胞凋亡明显增加。细胞凋亡在对照组和DES组不同时间点的动态变化以及在两组间相同时间点的差异可能与Bcl-2表达的减少以及Bax表达的增加有关。
