崔建武
- 作品数：15 被引量：32H指数：4
- 供职机构：军事医学科学院附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 新型重组IL6D24PE40KDEL外毒素融合蛋白的理化分析
- 2004年
- 为了对构建成功的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白的部分物化表征进行分析鉴定 ,采用Edman法、SDS PAGE法、胰蛋白酶消化的MALDI TOF MS质谱法、蛋白印迹法和MTT法分别测定该融合蛋白的N 末端 6个氨基酸、相对分子量、肽谱、抗原特异性以及靶向杀伤生物学活性。结果表明 :所构建表达纯化的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白N末端 6个氨基酸序列为Met Ile Asp Lys Gln Ile ,而IL 6缺失 2 4个氨基酸后的原序列为Ile Asp Lys Gln Ile ,由于采用了大肠杆菌表达系统 ,因此在N末端第 1位多出了 1个Met,经12 %SDS PAGE蛋白电泳和凝胶成像系统分析计算 ,其相对分子量为 5 8.75kD ,与理论值 5 6.9kD相比误差在5 %之内。MALTI TOF MS质谱测定共获得 10个与理论预测值相符的肽段 ,经瑞士生物信息研究所的EXPASY分子生物服务网站的Peptident数据库搜索证明 ,在分子量为 5 7kD左右的范围内未检索到与上述条件相符的已知蛋白 ,证明本融合蛋白为全新蛋白 ,与预测的目的蛋白相符。WB实验显示IL6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白能与IL 6及PEA抗体特异性结合。MTT生物活性测定表明 ,该融合蛋白对表达IL 6R的多发性骨髓瘤细胞系U2 66产生特异性杀伤 ,而对不表达IL6R的CEM淋巴细胞系无任何杀伤。结论
- 崔建武郭斯启孙玉英刘楠梁飞奚永志
- 关键词：纯化鉴定
- 重组人干细胞因子/血小板生成素融合蛋白的纯化及复性研究被引量：3
- 2005年
- 目的 探讨重组人干细胞因子/血小板生成素(SCF TPO)融合蛋白纯化及复性的最佳方法。方法 裂解 法提取包涵体,在变性条件下利用金属螯和层析获得融合蛋白,经透析及谷胱甘肽氧化还原法对纯化的融合蛋白进 行复性。结果 获得具有初步生物学活性的SCF TPO融合蛋白,其纯度高达90%。结论 该纯化方法操作简捷, 特异性高,纯化效果好,获得率高。
- 刘楠奚永志孙玉英郭斯启袁志宏崔建武习彩霞梁飞孔繁华
- 关键词：包涵体纯化复性
- 人重组造血生长因子双体分子的构建表达及结构特性分析
- ＜正＞ 目的:分子设计并构建较单体分子具有半衰期更长、生物活性更高的新型重组人干细胞因子（SCF）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和血小板生成素（Tpo）的双体分子（分别简称S-S、G-G、T-T）,并在原核系统进行高...
- 郭斯启奚永志孙玉英崔建武刘楠梁飞孔繁华
- 文献传递
- 构建靶向杀伤白血病细胞的新型重组白细胞介素6D24-PE40KDEL融合蛋白被引量：9
- 2003年
- 目的 构建能高度特异地靶向杀伤高表达白细胞介素 6受体 (IL 6R)白血病细胞的新型重组IL6 PE4 0KDEL(绿脓杆菌外毒素 )融合蛋白。方法 通过定点诱变将绿脓杆菌外毒素PE4 0基因羧基端最后 5个氨基酸REDLK替换成内质网蛋白滞留序列 (KDEL) ,采用重叠延伸的基因融合技术将N 末端缺失 2 4个氨基酸的人IL6 (IL6D2 4 )cDNA与PE4 0KDEL基因进行重组融合构建 ,利用HB10 1/pBV2 2 0表达系统实现该新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 ,经MonoQ柱层析纯化后 ,以四甲基偶氮唑类似物 (MTS)法检测IL6D2 4 PE4 0KDEL的靶向杀伤活性。结果 构建的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL融合蛋白在大肠杆菌中的表达水平达到 4 0 %左右 ;经包涵体分离、复性、变性及纯化所得该融合蛋白纯度 >95 % ;纯化的融合蛋白能与IL6抗体及绿脓杆菌外毒素A(PEA)抗体发生特异性结合 ;IL6D2 4 PE4 0KDEL融合蛋白能高度特异地选择性杀伤高表达IL6R的U937细胞 ,IC5 0约为 2 5 0ng/ml,而对不表达IL6R的人T淋巴白血病细胞系则无杀伤作用。结论 成功构建了具有靶向杀伤高表达IL6R白血病细胞的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL融合蛋白 ,为深入地探索利用IL6 /IL6R系统介导靶向治疗高表达IL6R白血病奠定了坚实的基础。
- 郑黎燕奚永志孔繁华崔建武粱飞刘楠孙玉英郭斯启
- 关键词：白血病靶向治疗内质网细胞毒试验
- 重组人干细胞因子／血小板生成素融合基因的克隆、表达及其蛋白质结构预测
- 2005年
- 目的:获得重组人干细胞因子／血小板生成素(SCF-TPO)融合蛋白的高表达,预测该全新型融合蛋 白的蛋白质结构。方法:设计引物,利用RT-PCR从胎肝细胞中扩增SCF和TPO氨基端功能区片段,采用基因融合 新策略将其融合成SCF-TPO融合基因,构建pET32a／SCF-TPO融合基因重组表达载体,在E．coli BL21(DE3)plysS 中获得正确高表达,采用生物信息学方法对融合蛋白的结构特征进行模拟分析。结果:首次成功构建了pEF32a／SCF -TPO原核表达载体,并获得了融合蛋白的高表达,表达量高达40％,主要以包涵体形式表达。蛋白结构预测结果 显示,融合蛋白的等电点、抗原性及亲水性无显著改变,接头序列具有高柔性。融合蛋白除一级结构有4个氨基酸发 生改变外,原来的α螺旋和β片层无改变。结论:获得了SCF-TPO融合蛋白的高表达,结构预测融合蛋白的设计符 合要求。为进一步研究SCF-TPO融合蛋白的生物学特性奠定了基础。
- 刘楠奚永志郭斯启孙玉英袁志宏崔建武习彩霞梁飞孔繁华
- 关键词：干细胞因子原核表达蛋白质结构
- 重组人G-CSF双体分子的构建表达及生物活性和结构特性分析
- 2003年
- 研究目的是分子设计并构建较G-CSF单体分子具有半衰期更长、生物活性更高的新型重组人G-CSF/G-CSF双体分子(简称G-G),并在原核系统进行高效表达。分别构建pET32/G-G和pET32/G原核表达载体,实现G-G双体融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,利用亲和层析等方法进行蛋白纯化;对该融合蛋白的结构特征诸如等电点、柔性、抗原性及亲水性进行模拟分析;采用MTT法对G-G双体融合蛋白的生物学活性进行测定。结果首次构建成功了G-G双体分子融合蛋白高效表达载体,表达量高于40％,一步亲和层析所获融合蛋白的纯度为80％左右。该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示,G-CSF双体分子的等电点、柔性、抗原性及亲水性均未显著改变。活性测定表明,所构建表达的重组人G-G双体分子能有效刺激G-CSF依赖细胞株NFS-60的增殖,但其刺激效应低于G-CSF的单体和标准品。结果表明,所构建表达的G-CSF的单体和G-G双体分子均可在大肠杆菌中获得高效表达,但G-G双体分子的比活性不及G-CSF单体分子,与预期设想的有差别,其原因正在研究之中。
- 郭斯启奚永志赵丹丹孙玉英崔建武刘楠梁飞
- 关键词：大肠杆菌
- 新型重组免疫抑制蛋白B7-2-L-PE40KDEL的分子构建与生物活性及结构特性被引量：5
- 2002年
- 目的 构建重组B7 2 L PE4 0KDEL融合蛋白 ,特异性杀伤CD2 8高表达的T细胞 ,选择性阻断T淋巴细胞活化过程中的B7:CD2 8/CTLA 4共刺激信号系统 ,由此诱导免疫耐受 ,特异性防治移植物抗宿主疾病 (GVHD)和宿主抗移植物疾病 (HVGD)。方法 采用基因融合序列重叠延伸 (SOE)策略 ,构建新型重组pRSETA B7 2 L PE4 0KDEL外毒素融合蛋白的原核表达载体 ,实现融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 ,利用亲和层析等方法进行蛋白质纯化。对该融合蛋白的结构特征诸如等电点、柔性等进行模拟分析。采用MTT法对其特异性杀伤高表达CD2 8受体的T细胞的活性进行测定。结果 构建并高效表达了B7 2 L PE4 0KDEL融合蛋白 ,所获融合蛋白的纯度大于 95 %。该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示 ,其柔性及抗原性、亲水性表位均未显著改变。活性测定显示 ,该重组融合蛋白能有效特异性地杀伤高表达CD2 8的人T淋巴瘤细胞系 ,而对未表达CD2 8的人白血病细胞系则无任何杀伤。结论 具有靶向性免疫抑制活性的新型重组B7 2 L PE4 0KDEL外毒素融合蛋白的构建、表达对特异性防治GVHD和HVGD可能产生积极的影响。
- 袁志宏奚永志张惠丽孔繁华关海容郭斯启刘楠梁飞孙玉英崔建武
- 关键词：生物活性淋巴细胞转化移植物抗宿主病免疫耐受
- 重组IL-6D24-PE40KDEL绿脓杆菌外毒素融合蛋白的表达、纯化及部分物化表征鉴定
- 利用细胞因子与其受体的特异性结合来导向传递重组细胞因子-外毒素融合蛋白,以达到选择性杀伤作为靶向治疗白血病及肿瘤的第二代导向杀伤策略,是现代分子导向药物研究与肿瘤治疗学的最新领域之一。迄今为止国内外学者已先后对IL-2/...
- 崔建武奚永志
- 文献传递
- 重组人干细胞因子-血小板生成素融合蛋白的表达及活性初步研究
- 2005年
- 目的研究重组人干细胞因子血小板生成素(SCFTPO)融合蛋白表达的最佳条件及其生物学活性。方法设计引物,利用RTPCR从胎肝细胞中扩增到SCF和TPO氨基端功能区片段,采用基因融合新策略将其融合成SCFTPO融合基因,克隆到pGEMT载体中,构建pET32a/SCFTPO融合基因原核表达载体,在宿主菌E.coliBL21(DE3)plysS中经异丙基βD硫代半乳糖(IPTG)诱导其高表达SCFTPO,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot检测。目的蛋白经包涵体变性,金属螯合层析纯化,透析复性,用细胞因子依赖细胞系MO7e进行细胞增殖实验。结果获得SCFTPO融合基因的高表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。Westernblot法鉴定表达正确,MTT法证明该融合蛋白具有细胞增殖活性,浓度为100ng/ml时刺激活性更强。结论表达并复性后的重组人SCFTPO融合蛋白具有刺激MO7e细胞生长活性。
- 刘楠奚永志郭斯启孙玉英袁志宏崔建武习彩霞梁飞孔繁华
- 关键词：SCF血小板生成素TPO活性复性IPTG
- 血小板生成素双体分子的融合构建、原核表达及其分子结构特性预测
- 2004年
- 目的为了研制更稳定、高效、低毒的血小板生成素(TPO),拟设计构建TPO的双体分子(TT)并在原核中表达,同时预测其融合蛋白的分子结构特性。方法采用分子克隆方法分别构建TPO单体分子与双体分子的原核表达载体pET32/TPO和pET32/TT,并在大肠杆菌中进行表达,以Westernblot鉴定表达产物;用生物信息学方法DSGene1.1和ProtScale软件,对该融合蛋白的结构特征如电点、柔性、抗原性及亲水性等进行模拟分析。结果成功构建TPO双体分子pET32/TT的原核表达载体,并经NcoI和NotI双酶切电泳及测序证实。通过转化origamiTM(DE3)感受态菌及IPTG诱导获得高效表达,其产量在40%以上;Westernblot显示表达产物能与抗TPO单克隆抗体特异性结合。对TT双体分子融合蛋白的结构特性预测表明,其融合蛋白中的两个TPO单体分子等电点、抗原性及亲水性均无显著改变,接头处具有高柔性。与TPO的原始序列相比,TT的一级结构中有2个氨基酸发生改变,在接头(L)后插入一段34个氨基酸的新序列(N)。此序列具有一定的抗原性和亲水性,呈现β片层结构。结论本研究所构建表达的TPO单体和TT双体分子均可在大肠杆菌中获高效表达,TT双体分子的结构预测符合设计要求,为进一步研究新型TT双体分子融合蛋白的生物学特性提供了基础。
- 郭斯启奚永志袁志宏崔建武梁飞
- 关键词：原核表达
