- 高转移潜能卵巢癌靶向肽的筛选及其对卵巢癌生物学行为的影响被引量：2
- 2014年
- 目的探讨高转移性人卵巢癌细胞H08910PM特异性结合短肽对卵巢癌生物学行为的影响。方法以H08910PM细胞为靶细胞，人正常卵巢上皮7311细胞和卵巢癌H08910细胞为吸附细胞，用噬菌体环七肽库进行4轮差减筛选。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光染色法对阳性噬菌体克隆进行鉴定。建立特异性短肽裸鼠腹腔移植瘤模型，分析其对裸鼠成瘤能力及侵袭、转移能力的影响。采用免疫组化法检测血管内皮生长因子（VEGF）的表达，原位末端转移酶标记技术（TUNEL）检测肿瘤细胞凋亡指数（AI）。结果经过4轮筛选后，噬菌体在H08910PM细胞上出现了明显的富集现象。ELISA结果显示，在随机挑选的20个噬菌体克隆中，有12个可与H08910PM细胞特异性结合。细胞免疫荧光显示，筛选的阳性噬菌体克隆能与H08910PM细胞特异性结合。黏附实验结果显示，H08910PM-peptide20组、H08910PM-peptidel6组和H08910PM组的细胞黏附率分别为49．O％、96．8％和100．0％，H08910PM-peptide20组与H08910PM组的细胞黏附率差异有统计学意义（P〈0．05），合成的特异性短肽序列peptide20（THRVHLH）能明显抑制H08910PM细胞的黏附能力。裸鼠体内实验显示，peptide20能够有效地抑制肿瘤的生长和转移，实验组、阴性对照组和空白组裸鼠移植瘤组织中VEGF蛋白的阳性表达率分别为21．2％、81．4％和85．7％，实验组的VEGF蛋白阳性表达率低于阴性对照组和空白组（P〈0．01）；而实验组、阴性对照组和空白组的A1分别为（18．214±2．49）％、（3．764±1．77）％和（4．784±1．57）％，实验组的AI明显高于阴性对照组和空白组（P〈0．01）。结论成功筛选到高转移性卵巢癌H08910PM细胞特异性结合短肽，其能够有效地抑制卵巢癌细胞的生长、侵袭和转移，为卵巢癌的药物靶向治疗提供了理想的载体。
- 周聪康佳丽王小霞聂妙玲蒋文燕
- 关键词：卵巢肿瘤细胞系肿瘤肽库
- RhoA基因沉默抑制卵巢癌腹腔移植瘤恶性生物学行为的研究
- 2013年
- 目的:研究慢病毒介导RhoA基因沉默对人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生长、侵袭及转移等恶性生物学行为的影响。方法:21只裸鼠随机分为HO8910-RhoA-shRNA组、HO8910-RhoA-NC组和HO8910组,每组7只。细胞接种法建立人卵巢癌腹腔移植瘤模型,每2天测量腹围。4周后解剖裸鼠,大体观察,测定腹水量,统计肿瘤播散器官数及瘤结节数。称量瘤体重量,并计算抑瘤率。镜下观察,应用HE染色分析移植瘤病理形态学特点。实时荧光定量PCR和Western blot检测移植瘤RhoA mRNA和蛋白表达情况。TUNEL技术检测移植瘤凋亡指数(apoptotic index,AI)。结果:与HO8910-RhoA-NC组和HO8910组比较,HO8910-RhoA-shRNA组裸鼠腹围增长明显滞后(P<0.05),腹水量明显减少(P=0.01),肿瘤播散器官数、瘤结节数及瘤体重量均明显减少(P均<0.001),抑瘤率达70.62%。RhoA基因mRNA和蛋白表达水平均显著下降(P均<0.001)。凋亡指数AI明显升高(P<0.001)。结论:慢病毒靶向沉默RhoA基因能显著抑制人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的恶性生物学行为。
- 蒋文燕康佳丽王小霞杨文娟聂妙玲周聪
- 关键词：RHOA异种移植模型抗肿瘤试验肿瘤浸润
- 靶向RhoA基因的shRNA对卵巢上皮性癌裸鼠移植瘤的影响及作用机制
- 2013年
- 目的探讨靶向RhoA基因的短发夹状RNA（shRNA）对卵巢上皮性癌（卵巢癌）裸鼠移植瘤的影响及可能的抗肿瘤作用机制。方法建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，应用随机数字表法将荷瘤裸鼠随机分为3组，即实验组（予携带靶向RhoA基因的shRNA慢病毒液治疗）、阴性对照组（予携带针对随机无关序列的shRNA慢病毒液治疗）、空白对照组（予磷酸盐缓冲液），比较3组裸鼠的移植瘤生长情况，包括移植瘤生长速度、肿瘤体积、肿瘤质量；光镜下观察3组裸鼠移植瘤及主要器官组织的病理形态学特征。采用实时荧光定量PCR技术、免疫组化SP法和蛋白印迹法检测移植瘤组织中RhoAmRNA和蛋白的表达；脱氧核苷酸末端转移酶介导的核苷酸缺口末端标记（TUNEL）法检测3组裸鼠移植瘤细胞的凋亡情况[以凋亡指数（AI）表示]。结果（1）自治疗开始的第9天起，实验组裸鼠移植瘤的生长速度滞后于阴性对照组和空白对照组，差异均有统计学意义（P〈0．01）。治疗结束后10d，实验组裸鼠的移植瘤体积为（338±114）mm^3，小于阴性对照组和空白对照组[分别为（1190±332）和（1101±396）mm^3]，分别比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）；实验组裸鼠平均肿瘤质量为（0．23±0．11）g，低于阴性对照组和空白对照组[分别为（0．79±0．19）、（0．74±0．17）g]，分别比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。而阴性对照组裸鼠移植瘤的生长速度、移植瘤体积、肿瘤质量分别与空白对照组比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）。光镜下观察，实验组肿瘤细胞呈大片坏死区域且核固缩多见，而阴性对照组和空白对照组肿瘤细胞无明显变化。（2）实验组裸鼠移植瘤组织中，RhoAmRNA的表达水平为0．304±0．05，低于阴性对照组的0．95±0．06和空白对照组的1．00±0．11，分别比较，差异均�
- 蒋文燕康佳丽王小霞杨文娟聂妙玲周聪
- 关键词：异种移植模型抗肿瘤试验
- 卵巢癌患者血清CAl53的表达及与临床病理特征的关系
- 2013年
- 目的探讨血清糖类抗原153（carbohydrate antigen153，CA153）在卵巢癌患者中的表达及临床意义。方法回顾性分析49例卵巢癌（A组）及62例卵巢良性病变患者（B组）术前血清CA153及血清糖类抗原125（CA125）的检测水平，并与术后病理结果等临床资料进行临床对比分析。结果卵巢癌患者术前血清CA153水平显著高于卵巢良性病变患者；血清CA153诊断卵巢癌的敏感度为40．82％，特异度为96．77％，其特异性显著高于血清CA125（P〈0．05）。卵巢癌患者分期越晚、组织分化愈差，其血清CA153检测水平越高；早期（I、II期）卵巢癌患者血清CA153的表达阳性率显著低于血清CA125（P〈0．05）。结论术前检测血清CA153有助于卵巢癌的筛查而协助诊断，术前血清CA153的表达水平越高提示卵巢癌不良预后的风险越高。
- 聂妙玲康佳丽夏薇邓玲红王小霞蒋文燕周聪
- 关键词：卵巢癌糖类抗原153糖类抗原125
- 全细胞差减筛选法筛选与人卵巢癌细胞特异性结合的短肽被引量：3
- 2013年
- 目的全细胞差减法筛选人源性卵巢癌HO8910细胞株特异性结合短肽,为卵巢癌的靶向药物治疗提供理想的载体。方法以人卵巢癌HO8910细胞为靶细胞,人正常卵巢上皮细胞为吸附细胞,对噬菌体随机环7肽库进行4轮差减筛选;ELISA验证阳性噬菌体克隆;对获得的阳性克隆进行DNA测序及生物信息学分析,采用免疫荧光细胞化学方法鉴定噬菌体阳性克隆(phage1)与HO8910细胞的特异性结合。结果经过4轮筛选后,噬菌体在靶细胞HO8910上出现了明显的富集现象;ELISA对20个随机挑选的克隆进行鉴定,12个可与HO8910特异性结合;DNA测序后得到一段与卵巢癌细胞特异性结合的7肽(SWQIGGN),免疫荧光细胞化学结果显示phage1能特异性结合HO8910细胞。结论采用全细胞差减法成功筛选到与卵巢癌细胞特异性结合的7肽。
- 周聪康佳丽王小霞聂妙玲蒋文燕
- 关键词：卵巢癌噬菌体展示全细胞靶向性
- 一种高效实用的人卵巢表面上皮细胞培养方法被引量：3
- 2013年
- 背景:体外分离培养纯度高、活力强且生物学特性稳定的卵巢表面上皮难度很大,目前原代培养主要采用组织块贴壁法和酶消化法,但这两种方法在取材、细胞活力及细胞纯度上都存在一定的问题。目的:建立一种高效实用的人卵巢表面上皮分离、培养和鉴定方法。方法:创新性地运用细胞刷刷取人卵巢表面上皮,以红细胞裂解法、差速贴壁法对细胞进行分离纯化,并向无血清DMEM-F12培养基中添加人表皮生长因子进行细胞培养。在倒置显微镜下观察细胞形态,应用苏木精-伊红染色和免疫细胞化学染色法对细胞进行鉴定,并绘制生长曲线。结果与结论:卵巢表面上皮培养24h开始贴壁生长,7-12d后基本达到融合,细胞呈多角形或扁平型,透光性及折光性强。细胞形态符合正常上皮细胞特性,所分离的细胞几乎完全表达上皮细胞表面标志物CK19。细胞生长良好,可以传6-8代,细胞生长曲线呈"S"形,纯度达95%以上。结果提示细胞刷取培养法操作简单,能够快速分离获得大量卵巢表面上皮,所获得的细胞经红细胞裂解法和差速贴壁法处理后纯度达95%以上,且细胞生长稳定。
- 周聪康佳丽王小霞杨文娟蒋文燕
- 关键词：原代培养苏木精-伊红染色免疫细胞化学
- 卵巢癌特异性结合肽的筛选及其对卵巢癌生物学行为的影响
- 目的与背景: 卵巢癌病死率居女性生殖器三大恶性肿瘤首位，在确诊时75％的患者已是FIGOIII期以上病变。发生远处转移、侵润和化疗耐药性是卵巢癌高病死率、预后差的关键因素。因此，临床上迫切需要探索卵巢癌治疗及其转移、复...
- 周聪
- 关键词：卵巢癌特异性结合肽生物学行为靶向治疗噬菌体展示
- 文献传递
- 人卵巢癌细胞特异性结合短肽的原核表达及靶向性分析被引量：7
- 2014年
- 目的通过原核表达的方式制备人卵巢癌HO8910细胞株特异性结合短肽(ovarian cancer specific binding peptide 1,OSBP-1)和氨基酸顺序重排的短肽(scrambled peptide,OSBP-S),探讨其对卵巢癌HO8910细胞的靶向特异性。方法构建pGEX-6P-3/OSBP-1与pGEX-6P-3/OSBP-S原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21(DE3),进行GST融合蛋白的诱导表达和纯化,纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析无误后,进行融合蛋白的酶切及小分子肽Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定,N端进行FITC标记。通过细胞免疫荧光和竞争性结合实验分析OSBP-1对人卵巢癌HO8910细胞株的靶向性,以及这种靶向性是否与特定的氨基酸顺序有关;通过亲和性试验研究OSBP-1与其他卵巢癌细胞、不同组织来源的肿瘤细胞及正常细胞的亲和性。结果成功构建了pGEX-6P-3/OSBP-1与pGEX-6P-3/OSBP-S原核表达载体;纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE分析显示,出现单一的GST-OSBP-1和GST-OSBP-S蛋白条带;蛋白质印迹法分析证明,融合蛋白能被GST单克隆抗体识别;小分子肽Tricine-SDS-PAGE表明,成功获得OSBP-1和OSBP-S;标记后的FITC-OSBP-1与FITC-OSBP-S经高效液相色谱技术和质谱分析,纯度均>95%。细胞免疫荧光实验显示,FITC-OSBP-1对HO8910细胞有很强的结合能力,能进入细胞内显示很强的绿色荧光,但其与正常卵巢上皮细胞仅个别细胞显示绿光荧光,而FITC-OSBP-S与HO8910细胞和正常卵巢上皮细胞均显示很弱的绿色荧光。另外,随着FITC-OSBP-1浓度的增加,HO8910细胞的荧光强度增强;竞争性结合实验显示,FITC-OSBP-1与HO8910细胞的结合能力随着OSBP-1浓度的增加而下降,平均荧光强度(mean fluorescent intensity,MFI)递减,分别为0.140±0.002 1、0.062±0.001 5、0.027±0.002 0和0.009±0.001 5,差异有统计学意义(F=3 111,P<0.001),而加入不同浓度OSBP-S的MFI无明显变化,分别为0.142±0.004 2、0.142±0.005 7、0.139±0.002 5和0.138±0.001 5,差异无统计学意义,F=0.874
- 钟嘉莉康佳丽廖花刘启才周聪王小霞
- 关键词：特异性结合短肽卵巢肿瘤原核表达靶向性
- 新型人上皮性卵巢癌细胞HO8910靶向输送系统的构建及其生物学活性的鉴定被引量：5
- 2014年
- 目的构建新型人卵巢癌HO8910细胞株靶向输送系统TAT-OSBP-EGFP,并对其靶向输送特性和体外活性进行研究鉴定。方法采用PGEX-6P-3质粒分别构建TAT-EGFP、OSBP-EGFP和TAT-OSBP-EGFP表达载体,重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达和GST SefinoseTMResin柱亲和层析纯化后,采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定。流式细胞术分析不同浓度(0、1、5、10μmol/L)TAT-EGFP、OSBP-EGFP和TAT-OSBP-EGFP融合蛋白处理HO8910细胞2h后的细胞穿膜率,细胞免疫荧光法检测3种融合蛋白对HO8910的输送特性(以人结肠癌Lo Vo细胞作对比),CCK-8法检测0、1、5、10、15、40、60、80、100μmol/L TAT-OSBP-EGFP处理HO8910细胞2h后的细胞活性。结果成功构建TAT-OSBP-EGFP原核表达载体,并获得可溶性融合蛋白。与TAT-EGFP相比,当浓度为10μmol/L时,TAT-OSBP-EGFP处理后HO8910细胞的穿膜率无明显升高(P>0.05);但当浓度为1、5μmol/L时,TAT-OSBP-EGFP处理后HO8910细胞的穿膜率升高,差异有统计学意义(P<0.01)。经TAT-OSBP-EGFP蛋白处理,HO8910细胞内荧光强度高于Lo Vo细胞;经TAT-EGFP蛋白处理,HO8910细胞内绿色荧光强度与Lo Vo细胞相似;经OSBP-EGFP蛋白处理,两种细胞内未见明显的绿色荧光。不同浓度TAT-OSBP-EGEP对HO8910细胞活性无影响(P>0.05)。结论成功构建针对人卵巢癌HO8910细胞株的靶向输送系统,为下一步肿瘤靶向药物输送载体的构建并发挥肿瘤的靶向杀灭作用打下了良好的基础。
- 廖花康佳丽蒋文燕王小霞钟嘉莉周聪
- 关键词：卵巢癌
- 高转移潜能卵巢癌靶向肽的筛选及其生物学特性研究
- 目的：采用噬菌体展示技术筛选高转移性人卵巢癌细胞H08910PM的特异性结合短肽，并研究其对卵巢癌生物学行为的影响，为卵巢癌的靶向药物治疗提供理想的载体。方法：以人H08910PM细胞为靶细胞，人正常卵巢上皮细胞和卵巢癌...
- 周聪康佳丽王小霞聂妙玲蒋文燕
- 关键词：噬菌体展示技术卵巢癌
