目的:探索粉尘螨变应原基因Der f1和Der f3改组条件,以期获得粉尘螨变应原融合突变基因。方法:RT-PCR方法扩增粉尘螨变应原Der f 1和Der f3基因,用DnaseⅠ分别酶解Der f 1和Der f3基因10、15、20、25、30 min;酶解相同时间的Der f1和Der f3基因片段两两混合,采用DNAshuffling技术对粉尘螨变应原Der f1和Der f3基因进行重组,琼脂糖凝胶电泳检测重组子。结果:以Der f 2 F和Der f2 R为引物在酶切10、15、20、25、30min均可扩增出清晰条带;以Der f1 F和Der f1 R、Der f1 F和Der f2 R、Der f2 F和Der f1 R为引物在酶切10、15、20、25、30min的模板中均无条带出现;而其他引物组合则在不同酶切时间的模板中均出现条带。结论:通过多种条件的组合,可获得多个粉尘螨变应原基因Der f1和Der f3间的融合基因,为大规模制备高效、低价的哮喘疫苗奠定了基础。
目的构建粉尘螨变应原ProDerf1原核表达载体pET28a-YARA—IhC—ProDerf1,为评价其免疫治疗效果奠定基础。方法用分子克隆技术构建出表达载体pET28a—YARA—IhC—ProDerf1,在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-IhC-ProDer f 1,并进行Ni^(2+)-NTA树脂柱亲和层析以纯化蛋白。结果经测序证实成功构建了表达载体pET28a-YARA-IhC-ProDer f 1,YARA-IhC-ProDer f 1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中得到表达,纯化后的蛋白浓度为278μg/ml。SDS-PAGE和Westem blot分析表明纯化蛋白为目的蛋白YARA-IhC-ProDer f 1。结论已成功制备出pET28a—YARA—IhC-ProD—er f 1原核表达载体,融合蛋白得到表达和纯化。
目的检测安徽省芜湖地区家庭空调隔尘网灰尘和空调开机前、后室内空气中粉尘螨Ⅰ类过敏原(Der f 1)和屋尘螨Ⅰ类过敏原(Der p 1)浓度,以探讨隔尘网中尘螨过敏原与哮喘发病的关系。方法分别从哮喘患者和健康居民家庭采集空调隔尘网灰尘样本各30份,同时用粉尘采样器采集哮喘患者和健康居民室内空气粉尘样本,开机前、后各采集30份。ELISA法检测Der f 1、Der p 1的浓度,Dot-ELISA检测灰尘提取液过敏原性。结果健康人群(家庭)组隔尘网灰尘中的过敏原Der f 1、Der p 1浓度中位数分别为1.49和1.28μg/g;哮喘患者(家庭)组隔尘网灰尘中的过敏原Der f 1、Der p 1浓度中位数分别为0.73和0.85μg/g,二者差异有统计学意义(分别为P<0.01,P<0.05)。健康人群(家庭)组的空调开机前空气中Der f 1、Der p 1浓度中位数分别为4.65和5.90 ng/m3,开机后分别为7.65和7.35 ng/m3。哮喘患者(家庭)组空调开机前空气中Der f 1、Der p 1浓度中位数分别为5.05和5.90 ng/m3,开机后分别为7.15和7.10 ng/m3。检测结果显示,打开空调送风情况下,哮喘患者(家庭)组与健康人群(家庭)组的空气中Der f 1、Der p 1浓度均比未开空调时高,且差异有统计学意义(P<0.05)。Dot-ELISA分析显示,灰尘提取液中过敏原能与螨过敏性哮喘患者的IgE产生结合反应。结论芜湖地区居民空调隔尘网中含有尘螨Ⅰ类过敏原,空调开启送风后空气中尘螨的2个主要过敏原浓度均显著升高,应重视家用空调的清洁与净化,定期清洗、更换隔尘网以防止或减少尘螨孳生。
