黄卫东
- 作品数：18 被引量：19H指数：3
- 供职机构：宁夏医科大学基础医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金宁夏医科大学校级科研项目宁夏回族自治区教育厅资助项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学文化科学更多>>
- 应用Bac-to-Bac系统高效表达人类错配修复基因hMLH1及其错义突变体
- 2017年
- 目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中实现人类错配修复基因h MLH1及其错义突变体的高效表达。方法分别用Bam HI和Not I双酶切构建于pc DNA载体中的全长野生型h MLH1基因及T117M和V384D错义突变型DNA片段,回收后定向克隆至p Fast Bac1转座载体中,经酶切鉴定后转化DH10Bac感受态细胞,PCR方法筛选阳性菌落,提取重组Bacmid,反复感染Sf9昆虫细胞,用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定目的蛋白的表达。结果提取转染72h后的Sf9细胞总蛋白,用7%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见分子量为85k Da清晰的蛋白条带,经Western blot方法证实该条带为h MLH1基因的表达产物。结论利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中大量表达出h MLH1野生型和T117M及V384D错义突变体蛋白,为进一步开展体外错配修复实验奠定了良好的基础。
- 郭嘉义张燕满耕孝朱明星黄卫东
- 关键词：HMLH1基因
- 应用改良的CRISPR/Cas9技术构建DPF2基因敲除肿瘤细胞模型
- 黄卫东
- 铜绿假单胞菌PAO1中4个具有GGDEF-EAL结构域基因的研究被引量：1
- 2016年
- 目的对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)野生型PAO1中与环鸟苷二磷酸(C-di-GMP)代谢相关的4个具有GGDEF-EAL结构域基因(PA0285、PA0575、PA5295、PA5442)进行初步研究。方法分析4个基因的转座子突变菌株进行生物膜(Biofilm)及泳动性(Motility);利用PCR对4个基因的催化结构域进行克隆并构建原核表达载体,经IPTG诱导后检测重组蛋白的表达情况。结果生物膜分析显示,PA0285、PA0575、PA5442的转座子突变体较野生型PAO1间生物膜合成发生变化,其A值差异有统计学意义(P=0.000,P<0.05);PA5295转座子突变体与PAO1间生物膜合成差异无统计学意义(P=0.232,P>0.05);泳动性分析显示,PA0285、PA0575、PA5442的转座子突变体菌落直径与PAO1比较差异有统计学意义(P=0.000,P<0.05),PA5295的转座子突变体与PAO1间比较差异无统计学意义(P=0.083,P>0.05)。4个基因的催化结构域原核表达载体构建成功,并在大肠埃希菌中表达目的蛋白。结论初步分析表明PA0285、PA0575、PA5442均影响细菌的生物膜合成及运动性,为4基因的功能研究奠定了基础。
- 满耕孝陈一帆张燕黄婷黄卫东
- 关键词：铜绿假单胞菌C-DI-GMP基因研究
- 铜绿假单胞菌中PA0847二鸟苷酸环化酶活性受非催化位点Y700调控
- 2024年
- 【目的】鉴定铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中PA0847胞内结构域及其突变体的二鸟苷酸环化酶活性,并初步探究其催化机制。【方法】利用刚果红平板染色法验证PA0847胞内域的二鸟苷酸环化酶活性;采用PCR技术构建PA0847 PAS-GGDEF结构域及其单点突变体,并经过表达纯化获得相应蛋白;经凝胶分子筛层析分析蛋白在溶液中的聚集状态;通过体外酶促反应鉴定蛋白的二鸟苷酸环化酶活性,基于噻唑橙荧光染色检测蛋白酶促反应后环鸟苷二磷酸(cyclic diguanylate monophosphate,c-di-GMP)的生成量,并筛选与二鸟苷酸环化酶活性密切相关的氨基酸残基;联用结构预测和分子对接获得PA0847 PAS-GGDEF二聚体以及结合三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate,GTP)的复合物结构模型。【结果】PA0847 PAS-GGDEF主要以二聚体形式发挥催化活性,PAS结构域促进二聚体形成,有效提高二鸟苷酸环化酶活性;突变筛选发现,在低蛋白浓度(0.6 mg/m L)下,非催化位点突变体Y700A活性较野生型显著提高;凝胶分子筛层析表明,其高活性可能与Y700A突变促进GGDEF(Gly-Gly-Asp-Glu-Phe)结构域二聚化有关;结构模型分析显示,PA0847 PAS-GGDEF与GTP结合位点保守,其中K722的氨基侧链在结合GTP的磷酸基团中发挥着重要作用,而Y700芳香环侧链与K722所在的α螺旋有疏水互作,因此Y700A突变可能改变了K722所在螺旋的空间取向,进而促进K722与底物GTP的结合以及GGDEF二聚化。【结论】铜绿假单胞菌PA0847的非催化位点Y700可间接调控二鸟苷酸环化酶活性。
- 肖王鑫杨婷婷黄卫东袁文肃张燕林志
- 关键词：铜绿假单胞菌
- 药学专业分子生物学实验教学改革探讨被引量：4
- 2013年
- 分子生物学实验技术是培养药学专业创新性人才的重要课程之一,从优化实验教学内容,改革教学实验方法及合理利用多媒体教学手段等几个方面进行了药学专业的分子生物学实验教学改革。通过近6年的摸索与改革,初步形成了一套实验教学体系,教学效果较为显著,不仅增强了学生的实验兴趣,提高了自主学习能力和实验技能,而且培养了学生的创造力和分析解决问题的能力,拓宽了科研思维能力。
- 张茜李燕杨怡张继荣高玉婧黄卫东孙玉宁
- 关键词：分子生物学实验教学药学专业
- 热休克蛋白60在激活的少突胶质前体细胞的表达
- 2013年
- 目的研究热休克蛋白60(HSP60)在重组人干扰素-γ(IFN-γ)和重组人热休克蛋白60(rhHSP60)激活的少突胶质前体细胞中的表达情况。方法分离SD大鼠的少突胶质细胞前体细胞(OPC),经IFN-γ和rhHSP60激活后,应用western blot方法检测细胞中的HSP60蛋白的表达;采用ELISA方法检测细胞培养液中炎症因子TNF-α及IL-6的释放量。结果经IFN-γ和rhHSP60分别激活后,OPC胞体内的HSP60蛋白表达均显著升高,胞外TNF-α及IL-6的释放量也明显增加。结论在激活状态下,OPC中的HSP60蛋白表达显著增高,刺激细胞产生大量炎症因子,从而参与细胞的应激反应。
- 李云鸿齐奇滕鹏成文静马骄张楠丁斐嘉李凡苗珍花黄卫东沈颖王银
- 关键词：热休克蛋白60
- 铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因的克隆及原核表达
- 2010年
- 目的克隆铜绿假单胞菌含Pilz结构域蛋白基因并构建其原核表达载体,为进一步研究这七种含Pilz结构域蛋白是否为第二信使c-di-GMP潜在的受体分子奠定实验基础。方法提取铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA,用PCR方法从中扩增出七种功能未知的含Pilz结构域蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。结果成功扩增出七种含Pilz结构域蛋白基因并构建其原核表达载体,测序结果与NCBI数据库收录序列相一致。SDS-PAGE检验证明目的基因在大肠杆菌BL21中获得高效表达。结论从铜绿假单胞菌基因组中成功地克隆了七种含Pilz结构域蛋白基因,其构建的原核表达载体在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。
- 黄卫东郭嘉义
- 关键词：铜绿假单胞菌基因克隆原核表达载体构建
- 一种鸟苷酸环化酶催化合成环鸟苷二磷酸的方法
- 本发明提供一种鸟苷酸环化酶催化合成环鸟苷二磷酸的方法，具体包括以下步骤：1)基因序列的获取；2)突变重组载体的构建；3)酶切；4)转化；5)诱导表达；6)破菌收集蛋白；7)蛋白纯化；8)蛋白透析；9)采用BCA法测定蛋白...
- 黄卫东郭嘉义张燕陈一帆芦晓红王银
- 文献传递
- 铜绿假单胞菌PA0861突变菌株表达谱检测分析被引量：6
- 2017年
- 目的分析铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1及PA0861突变菌株基因表达谱,探讨铜绿假单胞菌中GGDEFEAL基因PA0861的生物学功能。方法以野生型铜绿假单胞菌PAO1及PA0861基因转座子插入失活的突变体菌株为材料,利用结晶紫染色方法进行细菌生物膜的表型分析;利用Microarray技术分析其基因表达谱的变化;采用半定量RT-PCR验证Microarray结果。结果 PA0861突变株生物膜的合成量在4、8、12h均高于PAO1(P<0.05),在12h时增加了近1倍;利用Microarray技术筛选出差异表达基因517个,其中319个上调,198个下调。生物分子功能注释和Pathway分类显示这些差异表达基因除涉及代谢过程中基本的物质变化和能量转换外,突变体PA0861中涉及铁载体生物合成基因的表达增高。半定量RT-PCR验结果一致。结论铜绿假单胞菌突株PA0861基因表达谱发生改变,其中铁载体生物合成基因高表达,提示c-di-GMP可能通过对铁载体的调控影响细菌生物膜的形成。
- 李九龙郭嘉义张燕陈一帆满耕孝黄卫东
- 关键词：铜绿假单胞菌C-DI-GMPMICROARRAY铁载体
- 人类错配修复基因hMLH1和hMSH2错义突变真核表达载体的构建及表达被引量：2
- 2010年
- 目的构建人类错配修复基因hMLH1和hMSH2错义突变真核表达载体并检测它们在瞬时转染细胞中的蛋白表达。方法重组pcDNA3.1-hMLH1-wt和pcDNA3.1-hMSH2-wt质粒为模板,用定点诱变的方法分别构建hMLH1基因和hMSH2基因错义突变真核表达载体,将诱变前后的重组质粒瞬时转染至HCT-116细胞(hMLH1基因缺陷型)或LoVo细胞(hMSH2基因缺陷型)中,免疫印迹法和免疫荧光法分别检测这两种基因在各自的转染细胞中的蛋白表达。结果测序证实,定点突变成功,构建出hMLH1基因错义突变pcDNA3.1-hMLH1-T117M和pcDNA3.1-hMLH1-V384D真核表达载体以及hMSH2基因错义突变pcDNA3.1-hMSH2-L390F、pcDNA3.1-hMSH2-Q419K和pcDNA3.1-hMSH2-Q629R真核表达载体。结果表明转染后,除hMLH1-T117M突变体蛋白表达缺失外,其余的野生型及突变型真核表达载体在转染细胞中均能表达相应的蛋白。结论成功构建了在人的肿瘤细胞系中能有效表达的两种hMLH1基因错义突变和三种hMSH2基因错义突变的真核表达载体,为进一步研究这些错义突变的病因学作用和功能意义奠定了实验基础。
- 黄卫东郭嘉义
- 关键词：HMLH1定点突变真核表达载体转染蛋白表达
