邓思
- 作品数：3 被引量：16H指数：3
- 供职机构：华南理工大学生物科学与工程学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- GST-SrtA融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定
- 金黄色葡萄球菌分选酶A(SrtA)是一种膜结合转肽酶，可将细胞质中合成的表面蛋白锚定菌体细胞壁肽聚糖上。SrtA的缺失或突变可降低病原菌的致病性，因此SrtA可作为抗感染靶酶，用于新抗菌药物的研发。此外，SrtA由于其独...
- 邓思
- 关键词：GST融合蛋白可溶性表达蛋白纯化活性测定
- 文献传递
- 分选酶A(SrtA)的GST融合表达、纯化及活性测定被引量：4
- 2012年
- 构建GST/金黄色葡萄球菌分选酶A(SrtA)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化分选酶,并利用展示在酵母表面的底物检测分选酶的活性。以pMD20-SrtA为模板,PCR扩增得到SrtA△N59基因,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达载体pGEX-SrtA△N59,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,GST亲和层析分离纯化得到SrtA△N59,与展示在酵母表面的底物序列QALPETGEE-linker-EGFP作用,产生游离的EGFP,通过酶标仪检测EGFP荧光强度确定分选酶的活性。结果显示,重组表达载体pGEX-SrtA△N59经IPTG诱导,表达出相对分子质量约为42 kD的融合蛋白,SDS-PAGE分析,该融合蛋白是以可溶形式表达。分离纯化得到的分选酶与底物作用,其荧光强度由568.66±12.14增加至921.43±13.02。以上结果表明,成功构建了重组表达载体pGEX-SrtA△N59,并在大肠杆菌中获得了可溶表达的有活性的分选酶。
- 邓思罗立新
- 关键词：GST融合表达纯化底物活性测定
- 分选酶A在pET32a(+)原核表达载体中的表达和鉴定被引量：10
- 2011年
- 旨在pET32a(+)原核表达载体中表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的转肽酶分选酶(SrtA)并进行鉴定。以合有pET22-srtA质粒为模板,设计并合成引物,PCR扩增得到SrtA_(△N24)和SrtA_(△N59)基因,经过BamHⅠ、XhoⅠ酶切,克隆入表达载体pET32a(+)中,构建重组载体pET32a-SrtA_(△N24)及pET32a-SrtA_(△N59),并转化入大肠杆菌BL21(DE3)。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物分别进行分析和鉴定。然后对重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达条件进行了优化。结果显示重组载体pET32a-SrtA_(△N24)和pET32a-SrtA_(△N59)分别表达出相对分子量为约42 kD和37 kD的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting检测显示其分子量与预期的大小相符合。成功构建了重组质粒pET32a-SrtA_(△N24)和pET32a-SrtA_(△N59),并且在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效融合表达。
- 朱芳邓思罗立新
