杨开宇
- 作品数：24 被引量：96H指数：8
- 供职机构：中国科学院微生物研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程医药卫生更多>>
- 牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中表达调控的研究被引量：11
- 1994年
- Shine-Dalgarno序列与起始密码子之间的距离与组成对凝乳酸原基因表达有明显的影响,可导致其表达水平有15倍之差。SD序列至ATG之间为15bp不利于表达,表达质粒中SD-ATG在7-11bP之间都有可能获得高效表达;但决定因素不是简单的长度,而是RBS附近可能的二级结构即△G的大小、SD序列及ATG中参与配对的碱基数目。将pTLC23中凝乳酶原cDNA3＇端非翻译区插入终止密码子TGA与转录终止子rrnBT_1T_2之间适当位置可提高凝乳酶原基因的表达,这可能是因为这段序列能形成由53个碱基对和8个碱基组成的稳定的mRNA二级结构,起到转录终止子的作用,而一般认为串联终止子对终止转录更为有效。
- 王革刘年娟杨开宇
- 关键词：凝乳酶原基因表达大肠杆菌
- 牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的表达被引量：12
- 1991年
- 以Tac为启动子构建了牛凝乳酶原B基因表达质粒pTaAC,转化大肠杆菌JM105,对数生长期加入0.1mmol/L IPTG能明显诱导凝乳酸原的产生。基因表达除受IPTG的影响外,也受温度的调节控制。在30℃培养,IPTG存在时,凝乳酶原产量极低;在42℃无IPTG的条件下,基因也能表达。按电泳扫描计算凝乳酶原蛋白占细胞可溶性总蛋白量的12—19%,按ELISA法测定凝乳酸原产量为80—100mg/L,经变性、复性及酸化有活性的凝乳酶产量为14—20mg/L。
- 张渝英周炜刘年娟杨开宇
- 关键词：基因表达
- 黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌被引量：11
- 1994年
- 从黑曲霉糖化酶高产株T21合成的糖化酶cDNA,经5＇端和3＇端改造后克隆到酵母质粒YFD18上,转化酿酒酵母。转化子的淀粉培养基平板检测,培养滤液蛋白电泳和糖化酶活力分析都表明,含有糖化酶基因表达质粒的酵母转化子能有效地分泌有功能的糖化酶到细胞外。实验证明酵母α因子启动子和分泌信号序列能促使黑曲霉糖化酶cDNA在酵母中表达和分泌,实验还表明,黑曲霉糖化酶原的翻译后加工序列很可能亦能被酵母识别,加工生成有功能的成熟的糖化酶。以上成功为构建有实用意义的淀粉水解酵母工程菌迈出了重要的一步。
- 唐国敏龚辉钟丽蝉杨开宇
- 关键词：糖化酶酿酒酵母分泌黑曲霉
- 大肠杆菌中表达外源基因的质粒和牛凝乳酶原的生产方法
- 本发明提供了一种用于在大肠杆菌中表达外源基因的重组质粒，它具有：启动子-AAGCATTGGTTAAAAATTAAGGAGGAA TTAAAAAATG-牛凝乳酶源基因；或者，启动子-AAGCATTAACTTTAAAAATT...
- 杨开宇刘年娟张渝英
- 文献传递
- 凝乳酶原Cys45-Cys50二硫键功能的研究被引量：2
- 1997年
- 凝乳酶原突变体Cys45Asp/Cys50Ser包含体溶解所需的温度、时间、pH条件均与野生型一样,而且其氧化再折叠行为与野生型类似,在同样的复性条件下最终都能获得正确折叠可活化的分子.这与缺失Cys250-Cys283二硫键的突变体大不相同,说明Cys45-Cys50二硫键对凝乳酶原正确折叠的贡献小于Cys250-Cys283二硫键,但这对二硫键的缺失使假凝乳酶的热稳定性显著下降,说明此二硫键在稳定酶的空间构象中起重要作用、另外,突变体Cys45Asp/Cys50Ser假凝乳酶的水解蛋白酶活性(P)与凝乳活性(C)均较野生型低,但是其C/P值比野生型高1倍.
- 唐兵杨开宇
- 关键词：凝乳酶原突变体
- 水解淀粉的酿酒酵母菌的构建被引量：8
- 1996年
- 把黑曲霉糖化酶cDNA,酵母磷酸甘油激酶基因启动子区和终止区以及酵母Ty因子的δ序列构建成整合型的糖化酶表达分泌质粒pKG 1。该质粒转化酿酒酵母Y33得到整合型转化子。转化子分泌糖化酶活力在3.0μ/ml以上,在以5％可溶性淀粉为碳源的培养基中静止培养7d,淀粉利用率达86％,生成酒精的浓度与以5％葡萄糖为碳源时相等。
- 唐国敏郗乔然钟丽婵杨开宇
- 关键词：水解淀粉酿酒酵母酒精发酵
- 凝乳酶β-转角突变体的构建、表达和性质分析被引量：4
- 1998年
- 为了阐明牛凝乳酶的第二个发夹结构中的Ⅵ型β转角的功能，利用基因突变技术，将该转角的氨基酸残基（Ｌｅｕ２０Ｇｌｙ２１Ｔｈｅ２２Ｐｒｏ２３Ｐｒｏ２４Ｇｌｎ２５）改为（Ｌｅｕ２０ＧｌｙＧｌｙＧｌｎ２５）、（Ｌｅｕ２０ＳｅｒＧｌｙＧｌｎ２５）或（Ｌｅｕ２０ＧｌｙＳｅｒＧｌｎ２５），得到３个突变牛凝乳酶原表达质粒ｐＭＣＧＧ，ｐＭＣＳＧ和ｐＭＣＧＳ。除ｐＭＣＧＳ不能在大肠杆菌中表达外，ｐＭＣＧＧ和ｐＭＣＳＧ均能以包含体的形式进行表达，且表达水平与野生型相当。像野生型凝乳酶原一样，ｐＭＣＧＧ和ｐＭＣＳＧ的表达产物经过变性复性，均能自活化为假凝乳酶，而且复性后的酶原突变体在ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ上的柱行为与野生型相类似，但突变体假凝乳酶的凝乳及水解酪蛋白活性均明显低于野生型。说明突变对酶原的折叠影响较小，但对酶的催化效率影响较大。
- 黎红晔张渝英董贻诚杨开宇
- 关键词：凝乳酶突变体
- 黑曲霉糖化酶高产和低产菌株糖化酶基因调控区的克隆及其分析比较被引量：12
- 1996年
- 以PCR合成的糖化酶高产菌株黑曲霉(Asp. niger)T21糖化酶基因5’近端非编码区588bp(EcoRI-BamHI)的序列为探针,从T21染色体DNA中克隆到近2.0kb的糖化酶基因5’端非编码区序列,并以此序列为探针从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T21的诱变出发株)的染色体DNA中克隆到1.5kb的糖化酶基因5’端非编码区序列。该二序列的分析测定结果表明,其结构特征与文献报道的黑曲霉糖化酶基因5’端非编码区的基本一致,被称为“核心启动子”(Core promoter)的TATAAAT框及GCAAT框,分别在翻译起始点的-109bp及-178bp处。此外,在曲霉amdS,amyB基因中已发现有调控功能的CCAAT序列存在于-449bp和-799bp处。高产和低产菌株糖化酶基因5’端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化。此实验结果为进一步研究黑曲霉糖化酶基因在转录水平上的调控规律打下了基础。
- 钟丽婵乔殿华唐国敏杨开宇
- 关键词：黑曲霉糖化酶基因克隆
- 牛凝乳酶的结晶及其二硫键的化学修饰被引量：2
- 1991年
- 为了配合凝乳酶的蛋白质工程,围绕酶的纯化,结晶和二硫键的化学修饰进行了研究。实验结果表明采用FPLC Mono Q柱代替DEAE-纤维素柱层析可以提高同工酶A,B及其降解组分C的分离效果并缩短纯化时间。以10mg/ml的纯凝乳酶B为出发材料,在4℃1.4—2.0mol/L氯化钠条件下进行培养可以获得外形近似为正立方体晶体。化学修饰的结果证明,凝乳酶的三对二硫键处于酶分子不同的空间部位。0.72mmol/L DTT在pH6.3条件下能还原处于分子表面的一对二硫键,经溴化氰降解分肽测定为Cys^(250)-Cys^(283),还原后引起活力下降25%。在二硫键之间引入汞原子其活力与还原酶,羧甲基化酶的活力大体相同,说明Cys^(250)-Cys^(283)在维持凝乳酶具有活力的空间构象中起着一定的作用。
- 黄葵陈世芝杨开宇
- 关键词：二硫键化学修饰
- 提高重组牛凝乳酶原的表达与复性的方法
- 牛凝乳酶原的高效表达与复性方法属于微生物和酶的技术领域。为提高重组凝乳酶生产中基因表达水平及复性率，本发明采用高效表达质粒可使牛凝乳酶原在大肠杆菌中表达量占细胞总蛋白的30-40％，采用优化的溶解包含体及再折叠的工艺可使...
- 杨开宇刘年娟张渝英
- 文献传递
