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家蚕V型ATP酶B亚基的克隆及表达特征被引量：2: 2016年; V型ATP酶(Vacuolar-type ATPase)是一种定位于细胞膜和细胞器膜上的氢离子转运酶。它利用ATP水解的能量将氢离子转运到液泡、囊泡或者胞外,从而维持细胞内正常的酸碱环境。V型ATP酶B亚基(V-ATPase B)作为ATP的催化位点,也有着非常重要的作用。为了探讨家蚕V-ATPase B(Bm V-ATPase B)的功能,首先从家蚕五龄幼虫的中肠c DNA中克隆了Bm V-ATPase B基因并构建原核表达载体进行原核表达,获得了重组蛋白,经质谱鉴定正确后,通过镍柱亲和层析的方法纯化了该蛋白并制备了多克隆抗体;最后分析了该蛋白在家蚕丝腺中的表达特征并利用免疫荧光对其在丝腺中的表达位置进行了定位。结果显示Bm V-ATPase B基因序列全长1 473 bp,预测蛋白分子量55 k Da,预测等电点5.3。通过Western blotting对家蚕5龄第3天和上蔟第1天幼虫丝腺的不同区段进行Bm V-ATPase B蛋白的表达特征分析,发现在两个时期该蛋白均在前部丝腺高量表达,而在中部丝腺和后部丝腺表达量相对较低。进一步对两个时期丝腺的不同区段进行免疫荧光定位,发现该蛋白在两个时期的前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺均定位于细胞层。利用激光共聚焦显微镜对该蛋白进行进一步的定位,发现该蛋白主要在丝腺的细胞膜表达。研究结果明确了该蛋白在丝腺中的表达模式,为深入研究该蛋白在蚕丝纤维形成中的作用奠定了基础。; 陈慧芳王鑫谢康李懿赵萍; 关键词：家蚕 WESTERN BLOTTING 免疫荧光定位

家蚕芳基贮藏蛋白新成员BmSP3的基因克隆与表达分析被引量：1: 2014年; 贮藏蛋白在家蚕幼虫5龄盛食期的脂肪体中高量表达,为家蚕变态发育提供重要的营养物质,已报道的家蚕贮藏蛋白成员包括BmSP1和BmSP2,其中BmSP2为富含芳香族氨基酸的芳基贮藏蛋白(arylphorin)。从家蚕5龄幼虫脂肪体中鉴定并克隆了一个新的芳基贮藏蛋白基因,命名为BmSP3(GenBank登录号:JQ043182)。该基因ORF全长2 091 bp,编码697个氨基酸,BmSP3与BmSP2具有较高的序列相似性。半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测显示:BmSP3在家蚕5龄第3天幼虫的脂肪体、表皮、生殖腺和头部中均有表达,其中在脂肪体中的表达水平最高,并且同一组织中雌蚕的表达水平明显高于雄蚕;BmSP3在4龄末幼虫的脂肪体中就有表达,5龄中期表达水平开始明显增加,到上蔟前达到最高峰,之后急剧下降。Western blot检测显示:BmSP3在家蚕幼虫阶段主要存在于血淋巴中,化蛹时转运至脂肪体中,在羽化前逐渐被降解。BmSP3基因的转录及蛋白质合成、转运特征与BmSP2极为相似。; 李建伟王阿蓉李懿黎治浪龚竞侯勇夏庆友; 关键词：家蚕基因克隆

饲料与桑叶饲喂的家蚕蚕丝品质分析: 2024年; 为明确人工饲料饲喂和桑叶饲喂对家蚕蚕丝品质的影响,借助扫描电子显微镜、氨基酸分析仪、电感耦合等离子体发射光谱仪、傅里叶变换红外光谱仪、二维广角X射线衍射仪等,系统性地对2种饲喂方式获得的蚕丝的形态、组成、结构与性能进行分析。结果表明:与桑叶饲喂所获得的蚕丝相比,人工饲料饲喂所获得的蚕丝在外观、蛋白质组分方面无显著差异,而在元素含量、脯氨酸含量、二级结构、结晶度等方面存在差异;大量元素中,除Na和Si外,其余元素在人工饲料饲喂蚕丝中的含量均显著低于桑叶饲喂蚕丝,微量元素Al、Cr、B在人工饲料饲喂蚕丝中含量低于桑叶饲喂蚕丝,而Fe、Mn、Zn、Cu元素的含量反之;脯氨酸在人工饲料饲喂蚕丝中的含量显著高于桑叶饲喂蚕丝;饲料饲喂蚕丝中β转角结构含量大于桑叶饲喂蚕丝,而无规则卷曲结构含量相反,其结晶度也较桑叶饲喂蚕丝的降低5.1%;人工饲料饲喂蚕丝具有更高的平均断裂应变,而桑叶饲喂蚕丝具有更高的断裂强度,但二者差异并不显著;虽然桑叶饲喂蚕丝与人工饲料饲喂蚕丝在部分元素、氨基酸和二级结构上存在一定差异,但反映到蚕丝力学性能上其差异并不显著,说明家蚕蚕丝品质受饲喂方式的影响不显著,人工饲料饲喂具有替代桑叶饲喂家蚕的可能性。; 黄晴苏振岳周一帆刘青松李懿赵萍王鑫; 关键词：蚕丝人工饲料桑叶饲喂方式

家蚕组织蛋白酶基因家族的鉴定及表达特征分析被引量：4: 2015年; 家蚕是鳞翅目完全变态昆虫,在其变态过程中伴随着巨大的形态变化,包括旧组织的解离和新组织的形成,在这过程中有多种组织蛋白酶参与。组织蛋白酶是一类细胞内蛋白酶,广泛存在于各个物种中,包括组织蛋白酶B、H、L等几个亚家族。对家蚕组织蛋白酶的研究将有利于阐明家蚕变态发育的详细过程。通过对家蚕基因组数据库进行筛选,共在家蚕中鉴定到13种组织蛋白酶,并对这13种组织蛋白酶的基本信息和表达模式进行了分析。另外,利用家蚕基因芯片数据和荧光定量PCR分析,鉴定编号为BGIBMGA004622的基因为卵巢特异表达的组织蛋白酶L亚家族基因。该基因全长1 209 bp,编码402个氨基酸。经过序列分析,该酶与其他物种的组织蛋白酶L具有较高的同源性,其活性位点高度保守,且与鳞翅目的组织蛋白酶L在进化上聚为一支。同时,对该基因进行克隆并原核表达,结果显示重组蛋白以包涵体的形式表达。定量PCR结果显示,该酶在蛹发育初期表达量逐渐升高,至蛹3 d达到最高值,推测其可能参与卵巢与卵母细胞的发育过程。; 李懿周小英黎治浪李建伟陈世达郭超侯勇赵萍; 关键词：家蚕组织蛋白酶变态发育卵巢

硝酸钙盐缩处理对生丝结构与力学性能的影响: 2022年; 为探究盐缩加工处理在提高生丝纤维柔软度和舒适性的同时能否改良生丝纤维的力学性能,该研究采用不同百分比和温度的硝酸钙溶液处理生丝纤维.通过扫描电镜、偏光显微镜、聚丙烯酰胺凝胶电泳、红外吸收光谱、力学性能测试等手段,对处理后生丝纤维的收缩率、直径、表面形貌、取向度、蛋白组分、二级结构和力学性能进行系统性分析.结果表明:硝酸钙盐缩处理后生丝纤维发生明显的溶胀和收缩变化,其良好取向被破坏,蛋白质发生一定程度的降解,且这些变化随着处理百分比及温度的增加越发明显.高百分比的硝酸钙溶液可改变生丝纤维的二级结构比例和力学性能,将百分比为46.8%的硝酸钙溶液在65℃处理后,生丝纤维的应变可提升至39.1%,但其应力却显著下降.; 王鑫李懿刘青松李心宁夏庆友赵萍; 关键词：硝酸钙力学性能

家蚕前部丝腺特异表皮蛋白Bm11721的鉴定及表达被引量：2: 2016年; 家蚕的丝腺是其丝蛋白合成和分泌的器官,根据其形态和功能的不同分为前部、中部和后部丝腺,前部丝腺不具有合成丝蛋白的能力,是丝蛋白构象发生转变的场所。剪切力在丝蛋白构象转变中起到重要的作用,其在家蚕前部丝腺主要由前部丝腺逐渐变细的管腔结构和富含几丁质及表皮蛋白的坚硬的内壁提供。鉴定家蚕前部丝腺新的几丁质结合蛋白,并调查其在家蚕幼虫不同组织的表达特征。通过几丁质亲和层析的方法在前部丝腺筛选并鉴定到一个新的具有几丁质结合功能的表皮蛋白Bm11721,其编码基因编号为BGIBMGA011721(Gen Bank Accession No.NM-001173285.1)。利用原核表达系统成功表达了该蛋白,通过Ni-NTA亲和层析的方法获得了Bm11721的重组蛋白并制备了多克隆抗体。组织表达分析发现无论是转录水平还是蛋白水平Bm11721均只在前部丝腺特异表达,且Bm11721蛋白在5龄期的前部丝腺中恒定表达。免疫荧光定位结果显示Bm11721蛋白定位在前部丝腺的内膜中,推测其可能与前部丝腺的机械硬度有关,为丝蛋白的构象转变提供剪切力。; 谢康王鑫陈慧芳李懿宋倩茹赵萍; 关键词：家蚕组织特异性表达免疫荧光定位

家蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂BmCPI40鉴定及时空表达特征被引量：1: 2015年; 【目的】鉴定家蚕(Bombyx mori)半胱氨酸蛋白酶抑制剂,并对其表达特征及调控进行分析,为深入研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂在家蚕变态发育中的作用提供数据支持。【方法】根据家蚕基因组数据库和Primer 5.0软件设计BmCPI40去信号肽引物,对家蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂BmCPI40进行克隆,利用Clustal X和MEGA4.0软件对BmCPI40进行氨基酸序列和进化关系分析。采用原核表达系统对重组的BmCPI40进行表达、纯化和抗体的制备。运用RT-PCR和q PCR技术在核酸水平分析BmCPI40时空表达特征,利用Western和免疫荧光技术分别对BmCPI40进行蛋白水平检测和组织定位。q PCR方法检测20E诱导条件下BmCPI40在家蚕体壁中的表达量变化。用20E处理细胞,双荧光素酶报告系统对BmCPI40启动子序列活性进行检测,探究BmCPI40调控方式。【结果】鉴定、克隆、表达了家蚕的半胱氨酸蛋白酶抑制剂,并命名为BmCPI40,其ORF全长366 bp,编码121个氨基酸,其中前18氨基酸构成其信号肽,编码蛋白质大小约为12 249.21 Da,等电点为4.43;进化树分析显示BmCPI40与一些病原微生物半胱氨酸蛋白酶的抑制剂结构域进化关系较近;BmCPI40的原核表达结果表明,重组的BmCPI40以可溶蛋白的形式表达;BmCPI40 5龄第3天各组织Western blot结果显示,其主要存在于家蚕表皮中,头部也有微量存在;时期检测结果表明,BmCPI40幼虫期表达量明显高于蛹期,眠期及变态期表达量下调明显,这与核酸水平的q PCR结果相一致,进一步的体壁免疫荧光定位证实BmCPI40主要存在于体壁的皮细胞周围;q PCR表明,20E诱导5龄第2天家蚕幼虫后,BmCPI40表达量减少;双荧光素酶检测结果显示,20E诱导细胞后,BmCPI40启动子序列荧光素酶活性下降,证实BmCPI40受到了蜕皮激素的抑制作用。【结论】BmCPI40的表达受到蜕皮激素的诱导下调,同时其可能参与了家蚕的蜕皮及变态发育过程。; 李建伟李懿周小英黎治浪陈世达田莎侯勇夏庆友; 关键词：家蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂蜕皮变态发育

家蚕空泡型ATP酶(V-ATPase)基因的基本信息及表达特征被引量：3: 2014年; 【目的】鉴定家蚕(Bombyx mori)中的空泡型ATP酶(vacuolar-type ATPase,V-ATP酶)A、B亚基的编码基因,并调查其在家蚕幼虫5龄第3天不同组织和上蔟时期丝腺不同区段的表达特征。【方法】利用生物信息学的方法鉴定家蚕的V-ATP酶A、B亚基的编码基因并在线预测V-ATP酶两个亚基所具有的结构域,采用软件将其分别与其他物种中V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列进行同源序列比对和进化树的构建,通过荧光定量PCR技术分析家蚕V-ATP酶A、B亚基的编码基因在5龄第3天家蚕各组织的表达情况。进一步利用向家蚕幼虫上蔟时期的气孔注射pH值指示剂溴酚蓝,对丝腺进行染色,通过颜色变化对丝腺不同区段的pH值进行调查。最后,采用荧光定量PCR对家蚕上蔟时期丝腺不同区段V-ATP酶A、B亚基编码基因的表达情况进行分析。【结果】获得了家蚕V-ATP酶A、B亚基的编码基因BGIBMGA008295(GenBank登录号NM_001098359.1)和BGIBMGA002241(GenBank登录号NM_001098358.1)。结构域预测发现这两个亚基均具有3个非常保守的结构域,分别为位于N端的β筒结构域、序列中部的核苷酸结合结构域和C端结构域。将这两个基因编码的V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列与其他物种V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列进行同源性比对和进化树的构建,同源比对结果发现不同物种中V-ATP酶A、B亚基的氨基酸相似度为90%,保守结构域间相似度高达95%以上,说明不同物种间V-ATP酶A、B亚基高度保守。进化树显示家蚕V-ATP酶A、B亚基与同属于鳞翅目的其他昆虫的V-ATP酶A、B亚基亲缘关系较近。5龄第3天家蚕各组织中V-ATP酶A、B亚基编码基因的荧光定量PCR结果显示,这两个基因主要在中肠、脂肪体、生殖腺和丝腺中表达。使用溴酚蓝染色的方法分析上蔟期丝腺不同区段的pH情况,结果显示家蚕后部丝腺、中部丝腺后区和中区为中性或碱性环境,中部丝腺前区pH急剧下; 王鑫李懿陈全梅衣启营谢康吴用赵萍; 关键词：家蚕丝腺组织特异性表达

利用家蚕杆状病毒表达家蚕肌质网型钙离子ATP酶蛋白被引量：1: 2015年; 肌质网型钙离子ATP酶(Sacro/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,Serca)负责将细胞中多余的Ca2+转运并存储于内质网中,从而维持细胞内适宜的Ca2+环境。家蚕Serca创造的细胞内及细胞外Ca2+平衡对家蚕正常生命活动的维持具有重要作用。由于Serca分子量较大并具有10次跨膜结构,很难在大肠杆菌表达系统中表达。为了获得具有生物学活性的重组Serca蛋白,利用p Fast Bac Dual载体构建了用于表达egfp和serca的双元杆状病毒表达载体,转染细胞后获得重组病毒,将重组病毒感染细胞后,成功地在细胞中表达了EGFP和Serca。通过荧光观察及Western blotting分析表明,感染后细胞中Serca和EGFP表达模式一致,从感染后48 h开始表达,在感染后96 h表达量最大。对获得的重组蛋白进行酶活分析,发现感染后48 h至120 h的细胞Serca酶活显著提高。表明具有生物学活性的Serca在此系统中成功获得表达,为深入研究Serca蛋白的功能奠定了基础。; 王鑫李懿陈慧芳周小英谢康赵萍; 关键词：家蚕杆状病毒基因表达酶活

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李懿

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