李丽琴
- 作品数：10 被引量：39H指数：4
- 供职机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划国家重点基础研究发展计划中央级公益性科研院所基本科研业务费专项更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 抗谷氨酸脱氢酶蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用
- 本发明公开了谷氨酸脱氢酶蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明将链球菌GDH基因的抗原性和疏水性进行分析，去除信号肽和跨膜区域后设计一对引物对GDH基因进行克隆，以大肠杆菌成功表达了WC-SS7的GDH蛋白，将纯化的G...
- 王淑杰蔡雪辉徐敏武佳斌刘永刚石文达李丽琴徐明明荣福龙
- 文献传递
- 高致病性PRRS VORF3基因在昆虫细胞中的表达与免疫原性研究被引量：2
- 2010年
- 为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3的结构、功能和免疫学特性,本研究根据GenBank登录的高致病性PRRSV变异株(HP-PRRSV) HuN4株ORF3基因序列,经序列分析去除其N端的一部分疏水性区域(1aa～49aa),设计合成引物。将扩增的基因连接于pFastBac HTb杆状病毒载体中,构建重组质粒pF-ORF3,转化至感受态DH10Bac中,获得重组杆粒rBac-ORF3。再将其转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rAc-ORF3。用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)分析表明GP3在昆虫细胞Sf9中获得正确表达,而且具有良好的反应活性。用纯化的GP3免疫小鼠,制备抗GP3多克隆抗血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其效价。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达了重组GP3,经GP3免疫的小鼠体内产生了较高滴度的特异性抗体,证明表达的GP3具有特异的免疫原性。
- 徐明明蔡雪辉刘永刚王淑杰王洪峰石文达李丽琴荣福龙
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3杆状病毒表达免疫原性
- PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗免疫特性的研究被引量：17
- 2010年
- 为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株疫苗的免疫机理和明确PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗各自的免疫特性,本实验分别采用PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗免疫PRRSV抗原和抗体阴性的健康断奶仔猪,免疫后21d用PRRSV变异株HuN4强毒攻毒,ELISA方法检测血清中PRRSV特异的抗体水平及TNF-α、IFN-α、IL-1、IL-6和CRP细胞因子水平,荧光定量RT-PCR方法检测病毒血症的发生和持续情况,并取主要器官进行病理组织学观察。结果表明:HuN4活疫苗组免疫后14d便可检测到PRRSV特异性抗体,攻毒后5d各细胞因子水平升高,攻毒后21d病毒血症完全消失,免疫后各器官没有明显病理变化,攻毒后临床症状和各组织器官病理变化轻微;JXA1株灭活苗组免疫期间没有检测到PRRSV特异性抗体,攻毒后5d～9d各细胞因子水平升高,攻毒后病毒血症持续存在,免疫后各器官有轻微病理变化,攻毒后临床症状和各组织器官病理变化比HuN4活疫苗组严重,但比对照组明显减轻。本实验表明,HuN4活疫苗能够快速有效的激发机体的体液免疫反应,在抵抗PRRSV变异株HuN4强毒攻毒时,临床症状明显优于JXA1灭活苗。
- 李丽琴蔡雪辉刘永刚王淑杰石文达徐敏荣福龙武佳斌徐明明田志军胡守萍
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征
- 应用荧光定量RT-PCR方法检测PRRSV变异株在仔猪体内动态分布被引量：5
- 2010年
- 为进一步了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株(HuN4株)在体内的动态分布规律和特点,探讨病毒对组织器官的嗜性,本研究将HuN4株和细胞传代致弱毒株HuN4-F65人工感染40日龄健康仔猪,分别于感染后1d、3d、5d、7d、10d、14d、21d和28d各迫杀2头,并应用建立的荧光定量RT-PCR方法对脑、颌下淋巴结、扁桃体、肺脏、肝脏和十二指肠等组织及血清中的PRRSV进行定量检测。结果显示:感染后HuN4组各器官病毒载量比HuN4-F65组高100倍,病毒载量峰值期出现在感染后7d,随后呈下降趋势。HuN4株在仔猪体内分布广泛,在21d的试验期内持续存在,并且各器官的病毒载量呈正态分布规律;而HuN4-F65株血清病毒载量较低,并且集中在单核巨噬细胞相对密集的扁桃体和颌下淋巴结,与HuN4株主要嗜性器官肺脏相比发生了改变。
- 荣福龙刘永刚孙广力王淑杰王洪峰石文达李丽琴徐明明孙刚田志军蔡雪辉
- 关键词：PRRSV变异株荧光定量RT-PCR
- 高致病性PRRSV HuN4株Nsp4的原核表达及其抗体水平检测被引量：2
- 2011年
- 为进一步研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Nsp4的免疫学特性,本研究根据PRRSV HuN4株序列,设计并合成用于扩增PRRSV HuN4株Nsp4基因的引物。将扩增产物与原核表达载体pGEX-6P-1连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。Western blot试验显示,Nsp4在大肠杆菌中获得较高水平的表达,并且具有良好的反应活性。利用该蛋白建立ELISA方法,检测PRRSV HuN4株感染仔猪的不同时间内的血清,并比较抗Nsp4,囊膜蛋白和M蛋白,N蛋白的抗体水平,结果表明Nsp4抗体升高的时间晚于囊膜蛋白和M蛋白、N蛋白出现的时间,同时抗体水平也低于其他蛋白。
- 董建国刘永刚石文达武嘉男王刚刘鹤徐明明荣福龙李丽琴田志军蔡雪辉
- 关键词：NSP4原核表达抗原性
- 猪链球菌WC-SS7株GDH基因的表达及GDH蛋白单克隆抗体的制备被引量：5
- 2009年
- 目的原核表达猪链球菌7型临床分离株WC-SS7的GDH蛋白,制备抗GDH蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法将临床分离的猪链球菌7型WC-SS7株的GDH基因克隆入表达载体pET-30a,转入大肠杆菌中,用IPTG诱导表达,用Ni化琼脂糖柱(Pierce)纯化的GDH蛋白免疫BALB/c小鼠,取鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过间接ELISA方法筛选阳性克隆,对抗WC-SS7GDH蛋白单克隆抗体进行特异性鉴定及亚型鉴定。结果表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳分析后,在约为52KD处可见一条明显的诱导表达带,说明GDH蛋白得到了正确的表达;细胞融合后检测为阳性的细胞株经过3次单克隆筛选,最终得到了6株能和GDH蛋白反应的能稳定分泌单抗的阳性细胞克隆,这些单抗通过Western鉴定结果显示其具有良好的特异性,6株单克隆抗体亚型鉴定结果显示其亚型均为IgG1型,且轻链均为κ链。结论本研究成功表达了WC-SS7的GDH蛋白,并获得了6株能和GDH蛋白反应的、能稳定分泌单抗的阳性细胞克隆,所获得的重组GDH蛋白及特异性单克隆抗体能用于猪链球菌结构和功能的研究,为猪链球菌临床感染血清学诊断方法的建立奠定基础。
- 王淑杰徐敏蔡雪辉武佳斌刘永刚王洪峰石文达李丽琴徐明明荣福龙
- 关键词：猪链球菌原核表达单克隆抗体
- 猪链球菌重组GDH蛋白间接ELISA检测方法的建立被引量：7
- 2009年
- 为建立猪链球菌快速诊断方法,本研究以纯化的原核表达的猪链球菌谷氨酸脱氢酶蛋白(GDH)为抗原,建立了检测猪链球菌抗体的间接ELISA诊断方法。实验确定了最佳抗原包被浓度为6μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,其作用时间为60min,兔抗猪酶标抗体的最佳稀释倍数为1∶2000,其作用时间为60min;判定标准为S/P值≥0.210时判为阳性,S/P值≤0.166时判为阴性,介于两者之间的判为可疑。实验结果表明该方法特异性、敏感性和重复性均较好,适用于猪链球菌所有亚型的抗体检测,为猪链球菌的流行病学调查提供了一种简便快速的血清学检测方法。
- 徐敏王淑杰蔡雪辉刘永刚石文达武佳斌李丽琴
- 关键词：猪链球菌间接ELISA
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7的原核表达及其多克隆抗体的制备被引量：1
- 2011年
- 为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp7的免疫原性,本研究将PRRSV Nsp7进行了原核表达。SDS-PAGE和western blot试验表明,Nsp7在大肠杆菌中获得大量表达,并且其具有较好的反应活性。采用Nsp7免疫小鼠制备多克隆抗体,并进行间接ELISA检测,表明多克隆抗体效价达到1∶32 000以上;间接免疫荧光试验表明,多克隆抗体能够特异性识别PRRSV的Nsp7,显示出Nsp7具有较好的免疫原性。本研究获得了高纯度可溶性的PRRSV Nsp7,并进一步制备多克隆抗体,为研究Nsp7蛋白的免疫学特性提供实验依据。
- 刘鹤刘永刚石文达王淑杰武嘉男董建国荣福龙李丽琴徐明明孙刚蔡雪辉
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒原核表达多克隆抗体
- 荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV疫苗免疫仔猪攻毒前后抗原在体内的动态分布
- 2010年
- 为了更好地了解高致病性PRRSV疫苗的免疫机理,试验应用荧光定量RT-PCR方法比较了PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗免疫仔猪攻毒前后PRRSV在体内动态分布的差异。结果表明:HuN4活疫苗组攻毒后,病毒在各组织中的含量明显低于JXA1灭活苗组和对照组;JXA1灭活苗组攻毒后,病毒在各组织中的分布、载量与对照组相似,但较对照组轻。说明HuN4活疫苗免疫仔猪攻毒后,能明显抑制病毒在各组织中的复制,其免疫效果明显优于JXA1灭活苗。
- 李丽琴蔡雪辉刘永刚王淑杰荣福龙石文达徐明明
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量RT-PCR
- 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3基因的原核表达被引量：1
- 2010年
- 为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白的结构、功能及免疫学特性,根据GenBank中已发表的高致病性PRRSV HuN4株ORF3基因序列,设计合成扩增PRRSV ORF3基因的引物。将扩增的基因克隆到表达载体pProEx HTb中,转化到大肠埃希菌BL21进行表达。Western blot分析表明,GP3蛋白在大肠埃希菌中获得正确表达,且具有良好的反应活性。将纯化的GP3蛋白免疫小鼠制备抗GP3多克隆血清,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其效价,结果在小鼠体内产生较高滴度的特异性抗体,证明PRRSV GP3蛋白具有良好的抗原性。
- 徐明明刘永刚王淑杰武嘉男石文达李丽琴荣福龙蔡雪辉
- 关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒原核表达抗原性
