目的选取婴儿利什曼原虫的Pepck和Gp63的优势表位基因,构建Pepck-Gp63二联优势表位的原核与真核重组表达载体并表达蛋白。方法用计算机分析预测磷酸烯醇丙酮酸羧基酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPCK)的二级结构及HLA表位,筛选出优势表位。根据本实验室之前对表面蛋白酶63(glycoprotein of 63×10^(3),GP63)用相同的方法分析而筛选的表位结果,把Pepck和Gp63的优势表位基因通过重叠PCR和酶切连接反应构建出重组原核表达质粒pET32a-Pepck-Gp63,并诱导其在大肠杆菌中表达;构建出重组真核表达质粒pVAX1-Pepck-Gp63,用脂质体转染法把真核质粒转染到NIH3T3细胞中表达。结果Pepck存在多个优势表位;测序结果表明二联优势表位基因Pepck-Gp63连接成功;PEPCK-GP63蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达并在SDS-PAGE电泳-考马斯亮蓝染色的结果中呈现相对分子质量为74×10^(3)大小的条带;细胞免疫荧光中被pVAX1-Pepck-Gp63转染的NIH3T3细胞呈阳性。结论成功构建重组原核表达质粒pET32a-Pepck-Gp63和重组真核表达质粒pVAX1-Pepck-Gp63,并分别在大肠杆菌和NIH3T3细胞中验证重组质粒能表达相应目的蛋白,为后续的免疫策略研究提供初步实验基础。
目的采用蛋白质组学方法,对长滩军团菌血清1型临床分离株(LL-1)与环境分离株(CD-1)全菌蛋白进行比较和分析,探索军团菌临床株与环境分离株是否存在蛋白表达差异,为进一步认识、研究军团菌提供依据。方法培养、收集CD-1与LL-1菌株,用超声兼尿素-3-[(3-胆酰胺丙基)-乙二胺]-1丙磺酸(CHAPS)-二硫苏糖醇(DTT)裂解法提取全菌蛋白,SDS-PAGE及Western blot对二者全菌蛋白进行初步比较,确定二者全菌蛋白表达存在差异后,采用双向电泳(2-DE)联合MALDI-TOF-TOF质谱深入研究,并对质谱鉴定的差异点进行Western blot验证。结果初步SDS-PAGE及Western blot试验表明,CD-1与LL-1存在蛋白表达差异。进一步的2-DE研究结果共获得142个蛋白。CD-1与LL-1相比,18个蛋白点表达上调、19个蛋白表达下调。对其中显著差异的四个点进行质谱分析、Mascot软件查询、蛋白数据库搜库后证实CD-1表达下调的为热休克蛋白70(Chaperone protein Dna K)和30 s核糖体蛋白S1(30S ribosomal protein S1);CD-1表达上调的蛋白为假想蛋白TP04_0359(hypothetical protein TP04_0359)和一个未知蛋白。对进行质谱分析的四个蛋白点进行Western blot验证确实是军团菌蛋白。结论 LL-1与CD-1蛋白表达存在差异,此试验为进一步研究军团菌毒力和致病及疫苗研制奠定了基础。
