陈林林
- 作品数：10 被引量：9H指数：2
- 供职机构：重庆医科大学检验医学院感染性疾病分子生物学教育部重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市自然科学基金国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 丙型肝炎病毒E1蛋白活化MAPK／ERK信号通路促进肝癌细胞增殖被引量：1
- 2012年
- 目的研究丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）编码蛋白E1的生物学功能。方法分别构建编码HCV重要蛋白E1、E2、NS3、NS5a、NS5b的腺病毒载体Ad—E1、Ad—E2、Ad—NS3、Ad—NS5a、Ad—NS5b；将重组并包装的腺病毒分别感染SMMC-7721细胞，测定感染滴度，通过RT—PCR方法在转录水平鉴定HCVE1、E2、NS3、NS5a、NSSb的表达，用Western印迹在蛋白水平鉴定E1蛋白的表达。腺病毒感染SMMC-7721细胞后，通过细胞增殖实验筛选生物学功能最明显的蛋白。将筛选到的Ad—E1感染SMMC-7721细胞，用MTS、结晶紫、细胞周期实验观察体外过表达E1蛋白对感染细胞增殖的影响；Western印迹检测p-ERK、ERK的表达；RT—PCR检测c—Myc、cyclinD1、c—Jun、c．Fos基因的表达。结果成功扩增了能够编码HCV重要蛋白E1、E2、NS3、NS5a、NS5b的高滴度腺病毒Ad—E1、Ad—E2、Ad—NS3、Ad—NS5a、Ad—NS5b，并且通过RT—PCR方法在转录水平鉴定了目的基因的表达，Western印迹方法在蛋白水平鉴定了E1蚩白的表达。通过细胞计数、MTS、结晶紫实验证实Ad—E1感染组细胞较对照组增殖速度加快，细胞周期显示Ad-E1感染组细胞34．38％处于S期，明显高于Ad—GFP（27．32％）（P〈0．05）对照组；Ad-E1感染绢p-ERK蛋白表达量增高，同时与细胞增殖相关的MAPK／ERK下游基因转录水平上凋。结论体外过表达HCVE1蛋白可以明显促进SMMC-7721细胞的增殖，其促增殖作用可能与MAPK／ERK信号通路的活化相关。
- 陈庆美刘娇单晓亮周帆权会琴陈林林唐霓
- 关键词：丙型肝炎病毒丝裂原活化蛋白激酶细胞增殖
- HCV核心蛋白抑制SFRP1基因启动子活性被引量：1
- 2013年
- 目的探讨HCV核心蛋白对Wnt信号通路抑制分子SFRP1启动子活性的影响。方法以人肝癌细胞系Huh7基因组为模板,扩增SFRP1启动子区不同片段(-407～-27bp,-837～-27 bp,-1 202～-27 bp,-1 619～-27 bp,-2 029～-27 bp),以pGL3-Basic为载体分别构建SFRP1启动子区截短报告质粒。将构建好的质粒与pRL-TK共转染HEK293细胞,确定启动子区活性最强区域;分别用编码HCV核心蛋白的腺病毒或GFP对照腺病毒感染已转染重组报告质粒的SK-Hep1细胞,观察AdCore对SFRP1启动子活性的调控作用。结果 SFRP1启动子区域-407～-27 bp片段活性最强;与pGL3-Basic对照组相比较,相对荧光素酶活性增加了37.31±4.45倍(P<0.01),pGL3-S2～S5的活性分别增加了28.74±2.47、13.56±2.52、12.97±0.87和8.29±0.09倍(P<0.01);HCV Core蛋白能够抑制SFRP1基因启动子区活性,其对pGL3-S1的抑制作用最强,与GFP对照组相比较,抑制率为63.8%±1.0%(P<0.01)。结论 HCV核心蛋白通过抑制SFRP1启动子区活性下调SFRP1基因的表达,可能参与Wnt/β-catenin信号通路的活化,并与原发性肝癌的发生密切相关。
- 权会琴聂丹周帆陈林林陈庆美单晓亮谢青唐霓
- 关键词：SFRP1启动子HCV核心蛋白
- 乙型肝炎病毒X蛋白抑制SFRP5启动子的活性被引量：3
- 2013年
- 目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)抑制分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)启动子活性的分子机制。方法:扩增不同长度的SFRP5启动子区片段,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-Basic上,并将构建好的重组质粒转染入正常肝细胞系LO2细胞,再分别感染编码HBx的腺病毒(Ad-HBx)或编码绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-GFP),荧光显微镜下观察病毒感染效率,检测萤光素酶活性以观察HBx对SFRP5启动子活性的影响。结果:(1)含不同长度的SFRP5启动子区截短突变报告质粒构建成功。(2)截短突变报告质粒的萤光素酶活性与pGL3-Basic对照组相比,分别为(6.32±0.04)倍(-478 bp～+47 bp)、(5.79±0.32)倍(-811 bp～+47 bp)、(3.59±0.34)倍(-1 235 bp～+47 bp)、(3.86±0.39)倍(-1 677 bp～+47 bp)、(3.26±0.42)倍(-2 072 bp～+47 bp)(均P<0.05)。过表达HBx可以明显抑制SFRP5启动子活性,抑制率分别为44%(-478 bp～+47 bp)(P<0.05)、46%(-811 bp～+47 bp)(P<0.05)、28%(-1 235 bp～+47 bp)、24%(-1 677 bp～+47 bp)和40%(-2 072 bp～+47 bp)。结论:HBx可以明显抑制SFRP5启动子区活性,可能导致SFRP5基因表达下调。
- 陈林林谢青单晓亮权会琴陈庆美周帆聂丹唐霓
- 关键词：乙型肝炎病毒X蛋白
- 乙型肝炎病毒X蛋白抑制SFRP5启动子活性的研究
- 目的探讨乙型肝炎病毒X蛋白抑制SFRP5启动子活性的分子机制。方法扩增不同长度的SFRP5启动子区片段,构建到pGL3-Basic载体上,并将构建好的重组质粒转染入LO2细胞,再分别感染Ad-GFP或Ad-HBx,通过检...
- 陈林林谢青单晓亮权会琴陈庆美周帆聂丹唐霓
- 关键词：HBX
- 乙型肝炎病毒X蛋白抑制Wnt信号通路拮抗因子SFRPs的表达及分子机制的研究
- 目的:原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界第三大导致死亡的恶性肿瘤。HCC发生的其中一个危险因素是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染。目前全世界约有4...
- 陈林林
- 关键词：乙型肝炎病毒X蛋白WNT信号通路启动子活性
- 丙型肝炎病毒核心蛋白稳定表达肝癌细胞株的构建及生物学研究被引量：1
- 2012年
- 旨在构建稳定表达HCV核心蛋白的稳定细胞系Huh7-Core并进行初步的生物学功能研究。利用PCR技术扩增HCV核心蛋白基因,通过酶切连接反应将目的基因克隆至载体pSEB-3Flag中,将重组质粒pSEB-3F-Core和辅助质粒pAmpho共转染Huh7细胞,经过Blasticidine抗性筛选,建立稳定表达HCV核心蛋白的肝癌细胞系Huh7-Core。采用RT-PCR、Western blot鉴定Huh7-Core细胞株中核心蛋白的稳定表达并采用MTS、结晶紫试验观察Huh7-Core稳定细胞株的增殖情况。结果显示,成功构建了表达HCV核心蛋白的稳定细胞株Huh7-Core。结晶紫、MTS试验证实Huh7-Core细胞较Huh7-3Flag细胞增殖速度增快,表达HCV核心蛋白的Huh7-Core稳定细胞株构建成功,Core稳定表达后可促进Huh7细胞生长速度。
- 单晓亮刘娇陈庆美周帆陈林林权会琴唐霓
- 关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白生物学功能
- 丙型肝炎病毒核心蛋白对Wnt信号抑制因子SFRPs甲基化修饰的影响被引量：2
- 2011年
- 目的探讨丙型肝炎病毒核心蛋白是否通过对Wnt信号抑制因子SFRPs的甲基化修饰,从而活化Wnt信号通路。方法将编码HCV核心蛋白的腺病毒(AdCore)或GFP对照腺病毒(AdGFP)感染SMMC-7721细胞,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测SFRPs基因mRNA的表达;用5-氮杂-2'-脱氧胞苷(DAC)对AdCore或AdGFP腺病毒感染的SMMC-7721细胞进行去甲基化处理,进一步采用甲基化特异性PCR(MSP)和DNA甲基化测序,检测SFRPs基因启动子区CpG岛的甲基化程度,Western blot检测甲基化转移酶Dnmts的表达。结果在HCV核心蛋白过表达的SMMC-7721细胞系中,SFRP2和SFRP5基因mRNA的表达量与对照组相比明显降低(P<0.05);甲基化分析结果表明:SFRP5基因启动子区CpG岛呈现高甲基化修饰;甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3a表达量增加(P<0.05)。结论 HCV核心蛋白可以促进SFRP5基因启动子区CpG岛的甲基化修饰,参与HCV相关疾病的发生。
- 陈庆美刘娇周帆单晓亮陈林林权会琴唐霓
- 关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白甲基化
- 丙型肝炎病毒F蛋白抑制肝癌细胞增殖功能的研究
- 2012年
- 目的研究HCV F蛋白的生物学功能。方法扩增目的基因片段，通过酶切连接方法将编码HCVF蛋白的基因片段克隆至载体pSEB-3Flag中，用构建好的重组质粒pSEB-3Flag-F转染Huh7、SMMC7721细胞，经Blasticidine抗性筛选，拟建立HCVF蛋白稳定表达的细胞株，用RT-PCR方法检测HCV-F基因的表达。通过MTS、细胞计数、结晶紫以及流式细胞检测实验观察F蛋白对转染细胞增殖和细胞周期的影响。计量资料分析采用t检验。结果成功建立了HCVF基因稳定表达的细胞株Huh7-F和SMMC7721-F，MTS、细胞计数实验均证实Huh7-F和SMMC7721-F细胞较对照细胞增殖速度减慢，Huh7-F稳定细胞株结晶紫定量爿值为1．072±0．070，对照组为1．387±0．005（f=-6．347，P〈0．05）；SMMC7721-F稳定细胞株4值为1．594±0．007，对照组为1．921±0．090（t=-4．81，P〈0．05）。流式细胞仪检测Huh7-F稳定细胞株48hS期细胞百分比分别为47．1妣±0．040／0，对照组S期细胞数为55．32％±1．45％（f=-7．99，P〈0．05）；SMMC7721-F稳定细胞株S期细胞百分比分别为30．75％±0．09％，对照组S期细胞数为33．23％±0．28％（f=-5．91，P〈0．05）。结论稳定转染HCVF基因可以明显抑制Huh7细胞、SMMC7721细胞的增殖。
- 周帆刘娇陈庆美单晓亮陈林林权会琴唐霓
- 关键词：肝炎病毒丙型肝细胞
- HCV核心蛋白抑制SFRP1基因启动子活性的研究
- 目的探讨HCV核心蛋白(HCV Core protein)对Wnt信号通路抑制分子SFRP1启动子活性的影响。方法以人肝癌细胞系Huh7基因组为模板,扩增SFRP1启动子区不同片段(-407～-27 bp,-837～-2...
- 权会琴聂丹周帆陈林林陈庆美单晓亮谢青唐霓
- 关键词：SFRP1启动子
- 乙型肝炎病毒X蛋白截短突变体的构建及其对Wnt/β-catenin信号通路转录活性的影响被引量：1
- 2014年
- 目的:观察乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)截短突变体在细胞内的定位及其对Wnt/β-catenin信号通路转录活性的影响。方法:采用PCR克隆全长野生型HBx基因,在此基础上,分别构建融合增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和缺失HBx基因C端49~154 aa、C端85~154 aa、N端1~57 aa+C端141~154 aa、N端1~57 aa或N端1~84 aa截短突变体的表达载体;激光共聚焦显微镜下观察HBx截短突变体在HEK293细胞中的定位;采用萤光素酶报告系统检测HBx截短突变体对Wnt/β-catenin信号通路转录活性的影响。结果:(1)成功构建了HBx截短突变体与EGFP基因融合的表达载体。(2)野生型HBx及截短突变体在HEK293细胞中具有不同的定位,其中N端缺失突变体主要定位于细胞核周胞质;C端缺失突变体在胞质胞核中呈均匀分布;N端+C端缺失突变体的定位类似于野生型HBx,主要定位于胞质,呈不均一的粗大颗粒,胞核中也有少量表达。(3)与野生型HBx相比,HBx C端49~154 aa、C端85~154 aa、N端1~57 aa+C端141~154 aa、N端1~57 aa和N端1~84 aa缺失突变体在Huh7细胞中均使Wnt/β-catenin信号通路的转录活性明显下降,分别下降了78.7%、84.7%、75.7%、93.8%和95.5%。结论:HBx不同截短突变体的细胞定位及对Wnt/β-catenin信号通路转录活性不同,提示HBx的不同功能区对Wnt信号的转录激活发挥着不同的作用。
- 谢青陈林林李治单晓亮聂丹段玉洁权会琴唐霓
- 关键词：乙型肝炎病毒X蛋白细胞内定位转录活性
