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人多瘤病毒KI和WU PCR检测方法的建立及应用被引量：3: 2015年; 目的针对人多瘤病毒KI株和WU株,建立一种快速、特异、灵敏的标准SOP,并初步应用于200例北京地区呼吸道感染儿童的NPA（Nasopharyngea Aspirates）的检测.方法设计巢式PCR和实时荧光定量PCR方法,检测KIPyV和WUPyV基因,并对扩增产物进行序列分析,比较其应用于儿童NPA的检测效果.结果 KIPyV和WUPyV的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测灵敏性分别为10拷贝/μl和1拷贝/μl,高于巢式PCR（500拷贝/μl）,两种检测方法中均无其他呼吸道病毒阳性扩增.TaqMan探针实时荧光定量PCR可重复性检测中KIPyV和WUPyV的CV值分别小于2.9％和1.95％.应用巢式PCR KIPyV和WUPyV阳性检出率为1.5％和8％,TaqMan探针实时荧光定量PCR检测检出率为12％、14％.结论本研究建立了一种灵敏性、可重复性好、特异性高的快速核酸检测方法,其在临床上有较好的应用前景。; 张骞郑文芝袁武梅麻粉莲郑丽舒; 关键词：逆转录聚合酶链反应

JY佐剂对人乳头瘤病毒18型L1蛋白病毒样颗粒黏膜免疫效果的影响: 2013年; 目的探讨JY佐剂对人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)18型L1蛋白病毒样颗粒(Virus-like parti-cle,VLP)黏膜免疫效果的影响,并观察鼻腔反复免疫后与HPV58、11和6型的免疫交叉反应。方法用含或不含JY佐剂的HPV18 L1 VLP分别经肌肉和鼻腔免疫BALB/c小鼠,并设PBS对照组,于第0、3、6周各免疫1次,免疫后第2、5、8周采血,ELISA法检测血清IgG抗体滴度;于第8周分离脾淋巴细胞并收集呼吸道灌洗液,采用IFNγELISPOT试剂盒检测细胞免疫效果,ELISA法检测黏膜免疫效果;鼻腔免疫各组取5只小鼠,继续免疫10次,每次间隔3周,收集第14、20、26、32和38周的血清,ELISA法检测HPV18 L1蛋白与HPV58、11和6型的免疫交叉反应。结果免疫3次后,不含或含有佐剂的HPV18 L1蛋白经肌肉免疫后的血清IgG抗体滴度(均为104.6)高于经鼻腔免疫后的血清IgG抗体滴度(分别为101.9和102.8)。含有佐剂的HPV18 L1蛋白经鼻腔免疫后呼吸道灌洗液中sIgA抗体浓度(30.06μg/ml)明显高于不含佐剂的HPV18 L1蛋白鼻腔免疫组(23.47μg/ml)(P<0.01),但肌肉免疫组未检测到sIgA抗体。含有佐剂的HPV18 L1蛋白经鼻腔免疫诱导的细胞斑点数明显高于不含佐剂的HPV18 L1蛋白鼻腔免疫组(P<0.01),不含佐剂与含佐剂的HPV18 L1蛋白肌肉免疫组诱导的细胞斑点数差异无统计学意义(P>0.05)。HPV18 L1免疫小鼠后的血清与HPV58、11和6型之间均有交叉反应,在第32周血清特异性IgG抗体滴度最高。结论 HPV18 L1 VLP经肌肉免疫后,其血清抗体水平高于鼻腔免疫组,但该蛋白鼻腔免疫后细胞免疫反应和黏膜sIgA抗体水平均高于肌肉免疫组;JY佐剂能增强HPV18 L1蛋白经鼻腔免疫后的小鼠细胞反应及黏膜sIgA抗体应答,但肌肉免疫组佐剂作用不明显;HPV18 L1蛋白反复鼻腔免疫后,可拓宽抗原保护谱。; 麻粉莲袁武梅张骞郑文芝赵智慧郑丽舒; 关键词：人乳头瘤病毒18 L1蛋白病毒样颗粒黏膜免疫

人多瘤病毒7 TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立: 2015年; 目的：建立人多瘤病毒7（HPyV7）核酸快速、特异的TaqMan探针实时定量PCR检测方法。方法：分别设计HPyV7特异性的引物与TaqMan探针，建立实时荧光定量PCR方法，并对其特异性、灵敏性和重复性进行评价；用建立的方法检测200份健康成人志愿者的血清和300份急性呼吸道感染住院儿童的鼻咽抽吸物样本。结果：所建立的实时定量PCR方法对HPyV7的检测灵敏度可达10拷贝/μL，检测线性范围为101-1010拷贝/μL，且实验特异性和重复性好（CV〈1.0%）；采用该方法，从200份血清样本中检出9份阳性标本。结论：建立了HPyV7 TaqMan探针实时定量PCR检测方法，为HPyV7的流行病学调查及其初步研究提供了技术手段。; 麻粉莲郑文芝魏田力张骞崔红郑丽舒; 关键词：TAQMAN探针实时定量PCR

呼吸道感染住院患儿Merkel细胞多瘤病毒检测及临床研究: 2017年; 目的:了解北京地区Merkel细胞多瘤病毒(MCPyV)在呼吸道感染住院儿童中的流行情况和临床特点。方法:采集北京友谊医院儿科呼吸道感染住院患儿的鼻咽抽吸物样本200份,并收集相应的患儿临床资料,采用TaqMan real-time PCR方法检测MCPyV LTAg基因,并经测序确认;MCPyV阳性样本同时检测常见的人呼吸道病毒混合感染情况。结果:200份标本中共检出MCPyV阳性6例,检出率3%;感染儿童年龄从6月到5岁,其中年龄≤3岁的占83.3%(5/6)。诊断包括支气管肺炎和急性支气管炎,临床表现包括发热、咳嗽、喘息。6例阳性样本均与其他呼吸道病毒混合感染,A型流感病毒和呼吸道合胞病毒混合感染最常见,6例阳性样本MCPyV载量均低于10拷贝/μL。结论:real-time PCR方法检测呼吸道感染住院患儿中MCPyV的感染率为3%,6例MCPyV阳性样本均与其他呼吸道病毒混合感染且MCPyV载量较低,不能认为MCPyV是儿童呼吸道感染的病因。; 魏田力郑文芝麻粉莲姚立红陈爱珺崔红郑丽舒; 关键词：呼吸道感染

人博卡病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备被引量：2: 2012年; 目的表达纯化人博卡病毒（human Bocavirus，HBoV）VP2蛋白，采用杂交瘤方法制备抗HBoVVP2蛋白的单克隆抗体。方法应用原核表达载体pET-30a和大肠埃希菌表达VP2蛋白，并用固定化金属亲和层析，纯化后的蛋白作为抗原免疫BALB／c小鼠，利用杂交瘤技术和间接ELASA方法筛选阳性的杂交瘤细胞，并对单克隆抗体进行分型检测和滴度测定。结果表达并纯化获得了重组HBoVVP2蛋白，利用杂交瘤技术得到单克隆IgG抗体，抗体效价达到1：4×10^5。结论利用HBoVVP2蛋白免疫制备了单克隆抗体，并具有较高的效价。本研究为快速诊断和研究HBoV打下基础。; 赵智慧薛鹏浩魏建民张骞郑文芝麻粉莲袁武梅郑丽舒; 关键词：人博卡病毒

住院喘息患儿偏肺病毒及呼吸道合胞病毒感染的研究: 魏美晨郑丽舒郑文芝刘玉华崔红

甲型H1N1流感病毒HA基因RT-LAMP检测方法的建立与初步应用被引量：9: 2011年; 目的:建立反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)检测甲型H1N1流感病毒HA基因的方法,并用于检测临床样本。方法:通过在线软件Primer Explorer V4设计H1N1 HA基因的RT-LAMP引物,建立RT-LAMP检测方法,并评价其灵敏度和特异度。结果:与传统RT-PCR方法相比,RT-LAMP检测方法具备更高的灵敏度,达到10个拷贝,并且具有良好的特异性;在76份呼吸道感染儿童的咽拭子标本中检测到2份阳性,与RT-PCR方法检测结果相同。结论:建立的H1N1 RT-LAMP检测方法灵敏特异,简单快速,具备H1N1现场检测应用前景。; 王翔张骞张钫袁武梅麻粉莲薛鹏浩赵智慧郑文芝郑丽舒; 关键词：甲型H1N1流感病毒 RT-PCR RT-LAMP

住院喘息患儿偏肺病毒及呼吸道合胞病毒感染的研究: 魏美晨崔红郑丽舒郑文芝刘玉华

干扰素λ1在CHO细胞中的表达被引量：1: 2013年; 目的构建干扰素λ1表达载体PCI-dhfr-λ1和连接增强子SP163的表达载体PCI-dhfr-SP163-λ1,并在CHO（dhfr-）细胞中表达.方法在合成的干扰素λ1基因中引入相应酶切位点,并通过融合PCR获得连接增强子SP163-λ1基因,测序正确后将该基因插入表达载体PCI-dhfr,构建重组表达载体PCI-dhfr-λ1和PCI-dhfr-SP163-λ1.将所构建的重组表达载体用脂质体法转入CHO（dhfr-）细胞,通过间接免疫荧光法和Western Blot鉴定了λ1蛋白的表达,应用细胞病变抑制法初步鉴定了λ1蛋白的抗病毒活性.结果成功构建了干扰素λ1真核表达载体PCI-dhff-λ1和PCI-dhfr-SP163-λ1.免疫荧光结果显示分别转染了两种表达载体的CHO（dhfr-）细胞均能表达干扰素λ1蛋白,SP163增强子明显增强了干扰素λ1蛋白的表达,Western Blot结果显示转染SP163的CHO（dhfr-）细胞表达干扰素λ1蛋白.通过细胞病变抑制实验,在转染细胞48h后的细胞培养液中检测到了干扰素λ1的抗病毒活性.结论本研究成功的在CHO（dhfr-）细胞中表达了干扰素λ1,表达的蛋白具有抗病毒活性,为进一步建立稳定表达干扰素λ1的细胞系提供了条件.; 袁武梅麻粉莲张骞郑文芝郑丽舒; 关键词：干扰素类

呼吸道合胞病毒TaqMan探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用被引量：1: 2012年; 目的：建立呼吸道合胞病毒（RSV）核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，并对临床样本进行检测。方法：比对编码RSV非编码蛋白的基因序列，选取其保守片段设计引物和探针，建立实时荧光定量RT-PCR检测方法，并与传统RT-PCR方法进行比较，分别对两者的灵敏性、特异性、重复性及临床样本检验的适用性进行评价。结果：所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于RSV的特异性检测。相对于传统RT-PCR方法100拷贝，反应的检测灵敏度，实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度达到10拷贝／反应，检测范围为1010-101拷贝／反应，且具有良好的特异性和重复性。从169份临床呼吸道标本中检出RSV阳性40例，高于普通PCR方法（31／169）。结论：建立了RSV的TaqMan探针实时定量PCR检测方法，并可用于临床鼻咽拭子样本的检测，在临床上具有较好的应用前景。; 郑文芝张骞魏建民薛鹏浩王翔赵智慧郑丽舒; 关键词：呼吸道合胞病毒 TAQMAN探针实时定量RT-PCR

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郑文芝

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