谢小丽
- 作品数：2 被引量：5H指数：1
- 供职机构：南开大学药学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学理学更多>>
- 利用原核表达系统一步法制备生物素标记蛋白质被引量：1
- 2014年
- 传统的蛋白质生物素标记多采用体外化学修饰法,涉及生物素和蛋白质的活化、透析和纯化等多种处理,该方法步骤繁琐,且对目的蛋白的损失较大。本实验利用原核共表达质粒pCDFDuet-1,将含有6个组氨酸标签的人己糖苷酶D(hexosaminidase D,HexD)的cDNA与生物素受体多肽(biotin acceptor peptide,BAP)DNA进行PCR拼接,连入pCDFDuet-1的多克隆位点1(multiple cloning site1,MCS1);将以大肠杆菌Trans5α基因组为模板克隆得到的生物素连接酶(biotin ligase,BirA)基因连入MCS2,构建重组质粒pCDFDuet-hexD-BAP-birA。初步验证后将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,利用0.1 mmol/L的IPTG和80μmol/L的生物素进行诱导表达,采用Ni-NTA亲和层析和超滤对HexD进行纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小(60 kDa)和纯度(90%以上)。以anti-HexD和链霉亲和素-HRP为抗体,Western blot检测发现,HexD-BAP表达正确,且被生物素标记;同时以4-MU-O-GalNAc为荧光底物,检测到生物素化标记HexD的糖苷酶活性为3.6 nmol/(min·μg),与未标记HexD的活性(3.06 nmol/(min·μg))相当。结果表明,可以利用BirA及其受体多肽,通过共表达质粒pCDFDuet-1,一步转化、表达和纯化,在大肠杆菌中进行外源蛋白的表达和生物素标记,且不改变目的蛋白的生物活性,可应用于免疫标记、互作蛋白的捕获等生物学研究。
- 谢小丽程剑松王晓敏梅香寒刘琳李静
- 关键词：原核表达生物素标记
- 戈谢病的药物分子伴侣被引量：4
- 2014年
- 戈谢病(Gaucher disease,GD)是一种由于β-酸性葡萄糖脑苷脂酶(acidβ-glucocerebrosidase,GCase)基因突变引起的常染色体隐性遗传疾病,也是发病率最高的溶酶体贮积病。突变GCase的内质网关联降解和靶向溶酶体运转受阻是主要病因。酶替代疗法(enzyme replacement therapy,ERT)和底物降低疗法(substrate reduction therapy,SRT)是临床采用的主要治疗方法,但只对未涉及神经病变的Ⅰ型GD有效,且存在体内稳定性差和难以透过血脑屏障等弊端。GCase酶竞争性抑制剂可在低浓度底物的胞质中与突变酶结合,诱导酶折叠和运转;在高浓度底物的溶酶体中与酶解离,释放酶分子。因此,基于竞争性抑制剂的药物分子伴侣(pharmacological chaperone,PC)成为最具前景的药物。结合本课题组对GCase PC的研究,本文介绍了GCase的结构、催化机理及目前GCase PC的研究进展。重点讨论了脱氧野尻霉素类、环己亚胺醇类、C-糖苷衍生物、氨基环醇类和双环类PC的构效关系,简单介绍了其他非糖来源的PC,最后展望了GCase PC的前景,指出了今后研究中的发展方向。
- 李京谢小丽王佳佳王晓敏李静王鹏
- 关键词：戈谢病
